以沙门氏菌为载体的口服DNA疫苗研究进展
熊俊 四川农业大学
沙门氏菌属是一群寄生于人或动物肠道内的革兰氏阴性、无芽抱的直杆菌，可分为肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌。迄今为止己报道了约2500个血清型，其中大多数为肠道沙门氏菌，仅有少数血清型属于邦戈尔沙门氏菌。根据其对宿主适应性和嗜性的不同，可将肠道沙门氏菌分成3个群:第一群具有专嗜性和高度适应性，所属菌的种类较少，如鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌等;第二群具有偏嗜性，在一定程度上适应于特定动物，该群所含血清型较少，如猪霍乱和都柏林沙门氏菌等;第三个群具有非适应性和泛嗜性，该群具有广泛的感染宿主，如鼠伤寒沙门氏菌等，能引起人和多种动物的沙门氏菌病。该群在医学、兽医学和公共卫生中具有十分重要的意义。沙门氏菌属于兼性胞内菌，通常寄居在细胞内，也可在体外无活细胞的培养基中生长。这样的特性，为其作为运送载体，将质粒运送至机体细胞内提供了可能。
1 沙门氏菌的基因缺失减毒
沙门氏菌均具有一定的致病性，若要成为疫苗载体必须具有良好的安全性，因此改造沙门氏菌，使其毒性降低是其作为疫苗载体的先决条件。通过基因工程技术，鉴定出了沙门氏菌毒力基因，并将其缺失，毒力大大降低，使其在宿主体内只能有限增殖。一些多基因缺失株，发生回复突变的可能更是十分微小，安全性得到很好的保证，达到了作为疫苗载体的基本要求。
2 aro基因缺失
沙门氏菌aroA、ar0C、ar0D基因分别编码3-磷酸莽草酸-1-梭乙烯基转移酶、分支酸合酶、3-脱氢奎宁酸脱水酶。它们控制对细菌生长起着重要作用的一些芳香族氨基酸的生物合成。aro基因缺失菌在体外培养时依赖培养基中含有的这些化合物生长，而缺失株在宿主体内获得这些化合物的可能性极小，只能有限增殖，从而起到减毒的作用。Hoiseth等采用Tnlo转座子随机插入法，首先将野生型鼠伤寒沙门氏菌的aroA基因缺损，构建成为减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207。目前该细菌已被广泛应用于携带DNA疫苗以及作为外源抗原基因的表达宿主菌。Hone等缺失了野生型伤寒沙门氏菌TyZ、xsP1820aroC、aroD双基因，分别构建成为减毒沙门氏菌菌株eoVgos和eDvgo6。ehat6eld等缺失了野生型伤寒沙门氏菌TyZ的aroA、aroe双基因缺失株。这些双基因缺失株大大降低了沙门氏菌的毒力，并且减少了菌株毒力回复的可能性。
3 asd基因缺失
沙门氏菌asd基因编码天冬氨酸乃半乳糖脱氢酶，该酶在细菌合成二氨基庚二酸(DAP)中起着重要作用。DAP为革兰氏阴性菌细胞壁主要成分肚聚糖中四肤侧链的一个组分，DAP的缺失直接影响到细菌细胞壁的完整性，导致细菌死亡。在哺乳动物体内和普通培养基中均不含DAP，因此asd基因缺陷的菌株无法在不含DAP的培养基或动物机体内正常生长。基于此，Nakayama等刚]成功构建了沙门氏菌的平衡至死系统，将asd基因替代抗性基因克隆到原核表达质粒中作为筛选标记，将重组质粒导入asd基因缺陷的菌株，通过基因互补效应使得质粒稳定存在于菌株中。平衡致死系统不使用抗性基因进行筛选，解决了菌体在宿主体内无抗生素环境下质粒丢失的问题，还避免了带有耐药基因的质粒将抗性基因转移给其他菌群的可能性，大大提高了质粒使用的安全性。
4 携带DNA疫苗的减毒沙门氏菌作为运送载体
沙门氏菌作为一种胞内菌能够通过吞噬泡进入细胞内部，进而为质粒的释放提供可能性。但减毒沙门氏菌荷载的质粒DNA是如何离开吞噬泡而进入胞液的，目前对这一机制目前尚不完全明了。在早期的研究中，人们认为吞噬泡内细菌因营养缺陷而死亡裂解后释放出的质粒DNA可能通过渗漏的方式从吞噬泡进入细胞质中。随后的研究中，人们认为也很有可能与细菌自身的特定转运机制有关系，如在一些革兰氏阴性菌中存在的111型分泌系统，可将菌体蛋白注入细胞质中，同样的机制也可能用于使质粒DNA穿过溶酶体膜进入细胞质。在体外试验中，不具有逃离吞噬泡功能的重组沙门氏菌可直接呈送质粒不具有逃离吞噬泡功能的重组沙门氏菌可将质粒DNA传递给腹腔原代巨噬细胞和树突细胞，而对于离体培养的细胞系，这种传递效率则极为低下。因此研究者认为，在不同的细菌与细胞之间很有可能存在特定的通道进行物质从溶酶体到细胞质的传递。
与肌肉注射DNA疫苗的免疫途径相比较，通过口服以减毒沙门氏菌为DNA疫苗载体的免疫方式具有许多的优势。首先，它具有抗原呈递的高效性。DNA疫苗通过肌肉注射或基因枪技术只能使极少量的质粒被APC细胞捕获，而通过减毒沙门氏菌运送的DNA疫苗能特异地将质粒DNA靶向传递纷相关免疫器官的APCs内，而后者比前者具有更强的抗原递呈作用。其次，减毒沙门氏菌本身可作为一种免疫佐剂，起到增强诱导勃膜免疫的应答的能力。类脂A是沙门氏菌的LPS的主要成份之一，可刺激宿主细胞释放多种细胞因子，提高机体的免疫应答。以细菌为载体的DNA免疫可采用口服、滴鼻等途径进行免疫，方便疫苗的群体接种，同时刺激产生粘膜免疫能有效阻止病原在粘膜表面的定居以及入侵。最后，携带DNA疫苗的细菌侵入宿主后，在一段时间内有限增殖，具有持续刺激机体，诱导产生抗体的作用。
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