猪附红细胞体病的分子生物学诊断方法
刘海涛 山东农业大学
目前附红细胞体病的诊断方法仍然是显微镜检，包括血液涂片染色镜检和直接镜检方法，即采取末梢血液制成血液滴片，直接观察红细胞是否变形及附红细胞体形态。鲜血悬滴镜检：该方法比较简单，是目前诊断附红细胞体的主要方法之一。取患畜静脉血抗凝后，滴一滴与载玻片上，加等量生理盐水稀释，在 400倍或者 1000 倍油镜下观察，可见红细胞边缘不规则，呈齿轮状、星状等。有的游离于血浆中能够自由游动，翻滚，扭转运动。
血涂片染色镜检：常用染色方法及染色结果主要是：吉姆萨染色呈紫红色，瑞士染色为淡蓝色，吖啶黄染色可见其单体，红细胞表面附着的附红细胞体数量不等，并呈各种形式排列。瑞氏染色后，在同一视野中可见附红细胞体呈紫红色、黄褐色、深褐色，有的具有折光性；吉姆萨染色的血片中，附红细胞体的大小、形态、排列以及其它情况均同瑞氏染色，不同之处是着色略有区别。
电镜检查：在透射电镜下，附红细胞体为大小不不等的小体，多为球形。较大的附红细胞体上可看到细长的纤毛且其表面膜上有突起。扫描电镜下，发现附红细胞体多为球型，偶见杆状，单个或多个呈小团状附着于红细胞表面。红细胞表面常见局部凹陷，个别红细胞表面形成洞，有些可见电子密度大的颗粒状物，无规则的分布于胞浆内。
用于附红细胞体病的分子生物学方法主要为分子杂交、聚合酶链式反应（PCR）以及微孔板杂交-酶免疫法定量检测方法。Oberst用噬菌体构建了 M.suis 的DNA 文库，并筛选出 KSU-2 克隆用 P32标记作为诊断用探针，与感染猪附红细胞体的猪血提取的 DNA 杂交反应较好，且特异性较强，不与未感染猪附红细胞体的血液提取 DNA 反应。1993 年他又用 PCR-DNA 杂交技术分别检测实验感染和自然感染猪附红细胞体。
Messick首次利用 E.suis 的 16SrRNA gene 保守区及其多变区设计引物进行 PCR 扩增，该实验灵敏度较高。张浩吉利用猪附红细胞体的 16SrRNA 基因设计引物扩增 522bp 的片段，敏感性可达到 160Pg，但在较低的退火温度下与猪丹毒丝菌有交叉反应。张浩吉建立了 PCR-微孔板杂交-酶免疫法定量检测方法。根据 E.suis 的 16SrRNA 基因序列和 Genbank 上的其他各种血营养菌比较在保守区设计了一对通用引物，在下游引物的 5‘端标记生物素，PCR 扩增出有生物素标记的产物，并设计了 E.suis的16SrRNA 基因的高变区的 5‘端地高辛标记的探针。PCR 扩增产物与链霉亲和素结合后与特异性的探针杂交，再与辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体反应，底物显色。通过级联放大，该法的敏感性比常规的 PCR 方法提高近 100 倍，且没有交叉反应。应该说现在分子生物学方法检测附红细胞体简单，快速，准确，所以目前最适用于临床兽医实验室检测。
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