猪瘟的临床诊断方式
宋枭 西北农林科技大学
兽医在猪瘟的临床诊断中主要根据测试体温、临床发病情况、特点、传播方式、易感动物、死后剖检观察的病理变化，可做初步诊断。
1. 血清学诊断
(1)病毒分离（VI）
病毒可以从组织匀浆、血清、血浆、肝素或 EDTA 收集的全血当中分离出来。扁桃体、回盲淋巴结、脾脏、肾脏、喉头淋巴结等含病毒组织。病毒也可用猪肾细胞 PK-15 或 SK6 分离。所用细胞、介质和试剂必须保证没有瘟病毒或其抗体。
(2)免疫荧光抗体试验( FAT)
免疫荧光抗体试验在冰冻组织上的病毒抗原检测是一种灵明而又特异的诊断方法，已被世界多个国家和地区作为猪瘟的法定诊断方法。扁桃体作为病毒的复制起点，是做 FAT 最合适的组织样品。对于亚急性或慢性病例，首选回肠远端作为组织样品。
(3)间接血凝试验（IHA）
A 正向间接血凝试验 是利用 CSFV 能够致敏红细胞，从而将待检血清经行 2 倍的梯度稀释后使之与抗原产生抗原抗体反应，出现红细胞的凝集反应，然后根据红细胞的凝集多少来判断结果。此法能够测出猪体内猪瘟抗体的效价，有简便易操作的特点，广泛用于规模化猪场的免疫抗体监测。缺点是不能够区分抗体效价是由于疫苗免疫还是野毒感染所引起。
B 反向间接血凝试验 通过提取猪瘟免疫血清中的 I g G 来致敏绵羊红细胞，用于检测 CSFV 抗原。该方法能够检测如脾脏、淋巴结、扁桃体等病原较集中存在的组织中的 CSFV 抗原。存在的问题是用于处理组织病料的方法有差异，所以易对组织中的血细胞造成干扰，使得非特异性凝集出现而难以判定结果，因而现在已较少应用。
(4)中和试验
A 兔体中和试验 是将 CSFV 与待检血清中和后接种到家兔体内，然后观察家兔的体温变化曲线。以血清稀释度在 1︰32 为标准值，当待检血样的血清稀释度大于该标准值时，表明被检血样血清含有足够的 CSFV 抗体水平；当待检血清稀释度小于标准值时，说明被检血样的 CSFV 抗体水平较低，应当立即对猪群进行紧急免疫接种。但是 CSFV会和与之同源性较高的BVDV在血清学上有交叉反应。所以血清检测时要分别对CSFV、BVDV 做中和试验，如果 CSFV 抗体效价高，则可能是 CSFV。要确切区分 CSFV 和BVDV，需要用到单克隆抗体技术和核酸探针技术。B 荧光抗体病毒中和试验（FAVN）是国际贸易指定方法。通过 PK-15细胞飞片培养。把待检血清置于 56 ℃条件下灭活 30 min 后做一定稀释，在与等体积的200 TCID50/0.1 ml 的病毒液作用约 2 h 后接入片上吸附 1 h 后加入维持液孵育 48 h 以上。
对照组的设立采用直接免疫荧光的方法进行荧光观察。可以发现对照组含有翠绿色光斑，而试验组无光斑。该方法的优点是操作简便，特异性强。缺点是仅能对病毒定性，不能对其定量。
C 过氧化物酶联中和试验（NPLA） 将稀释后的待检血清与 200 TCID50/50 μL 的病毒液混合培养上一段时间后接入细胞生长。在细胞长到单层后固定后加入猪高免抗CSFV 血清，随后通过滴加辣根过氧化物酶标记的猪抗 Ig G(Ig G- HRP)和底物作用后显色，最后以显示的颜色来判定结果。NPLA 的优点是其结果可以通过肉眼进行判定，且无需飞片。
(5)酶联免疫吸附试验（ELISA）
该方法是用已知 CSFV 抗原包被板，将待检血样血清稀释后加入包被板板孔中，在一定条件下反应后加入 HRP 标记的葡萄球菌蛋白 A（PPA）或其他可与抗体结合的物质，然后作用一定时间之后加入底物并显色，在短时间内用酶标仪读取每个板孔的 OD 值，最后根据特定的判定方式来判定每个结果。ELISA 方法操作相对简单，短时间内可得结果。但是据报道目前的 ELISA 方法的敏感性比不上细胞上的病毒分离。此外，仔猪待检血清样品的敏感性明显高于成年猪或亚临床感染猪。为了补偿诊断敏感性的缺陷，猪群内所有表现发热症状的个体逐个进行检测，并且不排除出现假阳性的可能。
2 分子生物学方法
(1) RT-PCR 技术
该技术是选定一个相对保守的基因区域来合成特异性引物，同时使用下游特异性引物将病毒的 RNA 反转录为 c DNA，最好用引物对其进行扩增，从而获得目标片段。
(2)荧光定量 PCR(FQ-PCR)
荧光定量PCR是由美国Perkin Elmer公司于1995年研制出来的一种核酸定量技术。根据所用荧光化学的不同可分为 2 种方法：荧光探针法和荧光染料法。荧光定量 PCR具有特异性强、灵敏度高、线性关系好等优点。
(3)环介导等温扩增技术(LAMP)
环介导等温扩增技术在 2000 年由日本学者 Notomi 等建立。该技术通过对靶基因的6 个区域设计 4 种特异性引物，利用链置换 DNA 聚合酶在等温条件下经过几十分钟就可扩增出靶序列。这样克服了 PCR 技术需要昂贵仪器设备的缺点，产物在不需任何仪器的条件下就可即时观察，适合于基层及现场使用。
(4)多重 PCR（Multiplex-PCR）
多重 PCR，又称复合 PCR 或多重引物 PCR，其反应原理、试剂和操作过程均与一般 PCR 相同。区别只是在于同一 PCR 反应体系中加入 2 对或 2 对以上的引物，同时扩增出多个核苷酸片段的方法。多重 PCR 具有高效性、系统性、经济简便性等多方面优点，能够快速而准确的诊断疾病。
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