印迹基因在克隆猪各组织中的甲基化
吴志强 四川农业大学
综合前言所述，印迹基因的正常表达，对于胚胎的正常生长和发育十分重要。由于DNA的甲基化是印迹形成和维持的最可能机制，印迹基因差异性甲基化区的DNA甲基化水平异常可能会导致印迹基因不表达或异常表达，从而影响胚胎的正常生长发育。
正因为印迹基因的正常表达如此重要，国内外许多畜牧研究小组对印迹基因甲基化水平经行了分析。ogawa等分析了8个印迹基因在克隆小鼠胚胎及胎盘的表达，结果显示IGFZ和Hj夕基因是表达异常的，并指出IGFZ的异常表达可能是导致胚胎和胎盘过度生长的原因，同时他们还利用亚硫酸氢盐测序法检测了这两个基因的甲基化水平，发现其甲基化水平是异常的。同年，在检测IGFZ和Hj夕基因在克隆小鼠胚胎和胎盘中表达时，发现类似的结果(IGFZ和HI夕基因是表达异常)，并指出HI夕和阶沪rn基因的DMR甲基化状态是异常。
Young等分析了克隆羊印迹基因的甲基化状态，发现12头克隆羊中IGFZR基因的差异性甲基化区呈低水平的甲基化，HI夕基因的差异性甲基化区域也存在不同程度的异常。李长雷等发现克隆山羊胎儿胎盘组织中Hj，基因第5个cpG岛的甲基化水平显著高于对照组，万Z夕基因相对表达量显著低于对照组;肺脏组织甲基化水平显著低于对照组，相对表达量显著高于对照组。
Lucifero等对8头克隆牛胎儿进行了甲基化分析，发现印迹基因snrPn在7头克隆牛胎儿中呈低甲基化状态。随后对牛人工受精胚、体外受精胚及体细胞克隆胚中SnrPn基因的表达及甲基化水平进行了研究。结果显示，在体细胞克隆牛胚胎中，SnrPn基因呈双等位基因表达，并且其差异性甲基化区存在甲基化的严重缺失，而在人工受精胚胎和体外受精牛胚胎中则无此现象。Long等分析了克隆牛心脑组织的差异性甲基化区及非差异性甲基化区的甲基化水平，发现克隆牛基因差异性甲基化区的甲基化变化程度要较正常牛大，而非差异性甲基化区变化水平则无明显变化。Liu等检测了自发流产的克隆牛胎儿中4个印迹基因DMR的甲基化水平，发现4个印迹基因均有不同程度的甲基化紊乱。chen等分析克隆牛不同组织中印迹基因甲基化状态时发现体细胞克隆牛肺脏中HIg基因甲基化程度显著低于正常对照牛，Xist基因甲基化程度与正常对照牛无显著差异。
上述研究结果显示:无论克隆小鼠、羊和牛都有被检测到存在印迹基因的异常甲基化。而目前有关印迹基因甲基化状态也主要集中在这3个物种上，在猪上的研究较少，也较晚。Park等曾报道猪卵母细胞、精子、体外受精胚、孤雌胚及附植前胚胎IGFZ/111夕基因印迹控制区DMR3的甲基化状态，诊释了该区域印迹形成的过程。wei等检测了印迹基因在克隆猪胎盘及附植前胚胎中的表达及甲基化状态，结果显示IGFZ和Hj夕基因在新生死亡克隆猪胎盘中的甲基化水平比存活克隆猪胎盘和自然繁殖猪胎盘高。而印迹基因在在克隆猪不同组织中的甲基化状态未见报道。
本试验以同期正常猪不同组织为对照，利用亚硫酸氢盐测序法检测了IGFZ/Hj夕基因和IGFZR基因DMRs在新生死亡克隆猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的DNA甲基化状态。结果显示，IGFZ/Hj夕基因DMRZ在新生克隆猪肺脏组织中处于超甲基化状态，极显著高于正常猪(P<0.01);IGFZR基因DMRZ在新生克隆猪肝脏中处于超甲基化状态，显著高于正常猪(P<0.05)，而在肺脏中处于去甲基化状态，极显著低于对照组(P<0.01)。结果说明IGHj夕基因在克隆猪肺脏组织中存在甲基化状态异常，IGFZR基因在克隆猪肺脏和肝脏中存在甲基化状态的异常。这与前面所述的其它克隆动物(克隆鼠、羊和牛上的研究结果类似，应该是克隆猪也有存在印迹异常的现象。然而这个结果与魏延昌等提到的Hj夕基因甲基化水平在存活克隆猪、死亡克隆猪和自然繁殖猪的甲基化水平差异不显著有一定的冲突。这可能与我们所取用的组织样品有关，我们是以克隆猪内脏组织为材料，也可能与克隆猪个体差异有关。这还需要更深入的研究。
魏延昌等还分析了克隆猪囊胚内细胞团和滋养层细胞的甲基化状态，发现IGFZ基因和Hl夕基因在内细胞团中的甲基化水平较正常，而在滋养层中的甲基化水平很低。并指出滋养层中这样异常甲基化可能与胎盘的发育异常有关，还推测印迹异常的细胞可能优先参与滋养层的形成，而印迹正常的细胞则优先参于内细胞团的行成。除了胎盘，克隆动物胎内器官一肺，也往往被检测到DNA甲基化异常。李长雷等研究新生死亡克隆山羊不同组织甲基化状态，结果发现克隆山羊胎儿胎盘组织和肺脏组织中Hj夕基因第5个CpG岛的甲基化水平显著高于正常对照羊，导致Hj夕基因表达量显著提高。Chen等发现新生死亡克隆牛肺脏组织，基因甲基化程度显著低于正常对照牛，而基因甲基化程度与正常对照牛无显著差异。因此，我们猜想在克隆动物内脏组织的分化、形成过程中会不会存在优先分化的现象。既内细胞团中印记异常的细胞优先参某些器官的形成(如肺脏)，而印迹正常的细胞则优先参与另一些器官的形成，这也需要去进一步的研究和发现。
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