猪链球菌2型基因工程亚单位疫苗的研究进展
徐国华 南京农业大学
基因工程亚单位疫苗又称重组亚单位疫苗或者生物合成亚单位疫苗。主要原理就是将目的抗原基因导入原核细胞或真核细胞，使其大量表达，然后再人工提取保护性肤链，与佐剂混合制成疫苗。猪链球菌2型目前尚无用于临床的商品化基因工程疫苗。随着对552毒力因子的研究深入，畜牧研究人员开始从毒力因子下手研究其免疫保护作用，从而来筛选合适的亚单位疫苗。目前研究报道的毒力因子有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、细胞外因子、溶血素、纤连蛋白结合蛋白、Sao蛋白等。
1荚膜多糖(Cps)
荚膜多糖存在于细菌的细胞壁，具有抗吞噬活性，在猪链球菌致病过程中发挥作用，与其他细菌荚膜一样，552荚膜同样表现出免疫原性，但是较弱，需要与其他毒力蛋白相结合才能有效刺激机体产生免疫反应。 BaumscG等人使用552荚膜偶联BSA免疫猪获得高价血清，并对其杀菌活性进行了评价。
2溶菌酶释放蛋白和细胞外因子EF
MRP存在于细胞表面，为细菌的胞壁蛋白，具有良好的免疫原性，理论上是良好的保护性抗原，可作为亚单位疫剂也影响亚单位苗的效价。另外，单独以MRP或EF进行免疫，其保护率也较高，但MRP免疫组的临床症状同EF免疫组相比显著减轻。另外，这种疫苗缺陷在于，由于亚单位苗的抗原成分单一，这对于天然缺乏这种毒力因子的552的感染起不到保护作用。研究表明，包含MRP和EF两种毒力因子的，以油包水为佐剂的亚单位疫苗可以有效预防高致病力猪链球菌2型的感染。
李明等以552溶菌酶释放蛋白(MRP)和胞外因子(EF)抗原性较强的基因序列，分别构建表达载体pET32a一MRP、pET32a一EF，westem方法确定诱导表达的两各蛋白都具有免疫原性后，串联表达后用融合蛋白MRP一EF免疫新西兰大白兔，以最小致死量552强毒株攻毒，存活率明显高于单个表达产物，证实串联表达的融合蛋白可以是重要的保护性抗原。
范红结等于2004年克隆了 552HA9801株MRp基因的部分抗原性较强的片段，表达出大小为42kDa的重组蛋白，经纯化、混合弗氏佐剂和免疫Balb/C小鼠，最后以5倍的LDS。的552强毒攻击，小鼠的存活率都较高，表明MRP具有较强的保护性抗原功能，也提示该片段部分为MRP重要的功能区。
5.3溶血素 (SLY)
猪链球菌2型溶血素(hemolysin)，也称猪溶素(suilysin)，是由552产生的释放至细胞外的具有细胞毒性作用的一种毒素。通过作用于红细胞膜上的胆固醇而溶解红细胞。1994年，JacobS从等对猪链球菌2型的溶血素进行了提纯，然后免疫Balb/C小鼠，结果显示小鼠得到了完全的免疫保护，证明猪链球菌2型的溶血素具有免疫保护作用，研究还发现，各种血清型的猪链球菌均能产生相似的溶血素，提示SLY可能具有较好的免疫交叉保护作用。1996年，他们将SLY和猪链球菌2型的其他细胞外抗原 (extracellularantigens)对猪的免疫保护作用进行了对比，证实猪溶血素的免疫保护作用要明显优于不含溶血素的其它细胞外抗原。2003年Luns等研究显示，猪链球菌2型的SLY在刺激细胞因子的释放和起始免疫过程中具有重要作用。2007年王华等扩增了四川552株s比的653bp大小的主要片段，表达出43kDa大小的融合蛋白，并能跟552的抗血清发生反应，小鼠实验表明，该蛋白的菌苗效应为60%，相比较于全菌灭火苗的80%的菌苗效应，其保护率已经相当可观。2008年杨影158]扩增出猪链球菌2型的sLY的全基因，表达的融合蛋白大小为57kDa，westemblot表明其具有良好的免疫反应性。
sLY作为亚单位疫苗的对象具有很多的优点，但是很多研究发现队59]许多552分离株都不含该蛋白，因此使用范围受到了极大的限制。苗的候选蛋白。EF仅能从培养物上清液中检出，为细胞外蛋白。对这两个蛋白的研究最多，也最深入。
Wisselink等报道，用亲和层析法提取552的这两种蛋白MRP和EF，再以不同的佐剂:油包水(awater-in一oilemulsion[w/o])和铝胶(alumiiuxn场droxide一basedadjuvant[AH1)制备成亚单位疫苗，并测定其免疫效果。分别在3周龄和6周龄的仔猪各免疫1次。8周龄时静脉注射同源或异源的552。结果表明，以MRP+EF/W/O进行免疫的保护作用同以油包水为佐剂的全菌灭活疫苗相当，能有效地保护552的感染。而以铝胶为佐剂的疫苗作用则大大降低，与用安慰剂免疫的对照组无明显差异。
5.4 552其他亚单位疫苗研究
LIY等人通过研究发现一种 110kDa蛋白，命名为sao蛋白。利用免疫电镜技术证明该蛋白表达于细菌表面，利用 WestemBlot证明在检测的33种血清型中有28种可以检测到sao蛋白。有实验证明，sao蛋白对表达sao变异体的菌株同样有保护性。
Yuanyi等人将纯化后的sao蛋白与QullA混合免疫6周龄的cD一1雌鼠以及4周龄的仔猪，可使它们对552的攻击产生一定的免疫保护作用。因此对于异源的552感染具有有效的免疫保护作用，证明其可作为猪链球菌的候选疫苗。
zharig等鉴定了552的一个新的保护性抗原:烯醇化酶，实验表明烯醇化酶可产生足够的抗体保护小鼠免受552的攻击。 deeree份等将552的纤连蛋白FBPs伍broneetin一 bindingprotein)的基因加s转入大肠杆菌中进行大量表达，将表达的产物提纯后免疫兔子，首免后28d进行二免，二免后第三周时将兔子处死，收集血清进行检测，可以检测到FBPS抗体的存在，证明猪链球菌2型的纤连蛋白有很好的免疫原性，可用于基因工程亚单位疫苗的构建。Wintethoff等发现并鉴定了两种分子量分别为 47kDa和53切a的细菌表面热应激蛋白，这两种蛋白与精氨酸脱氢酶系统高度同源，并与荚膜多糖相伴出现，可刺激机体产生免疫应答。
Gottschalk通过以高致病力的552为基础构建了两株无致病力的细菌突变株，通过对比发现一种分子量为 44kDa的胞壁蛋白存在于亲株中，而在突变菌株中则不存在，该蛋白具有很好的免疫原性，是552的毒力因子之一。
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