两种鉴定猪睾丸组织的方法
廉传江 吉林大学
1.直接克隆测序方法
小 RNA 分子的直接克隆测序仍然是目前鉴定 miRNA 的主要方法之一。miRNA 的克隆是利用 T4 RNA 连接酶在小 RNA 分子的两端连接上接头序列，随后反转录成 cDNA 文库克隆到质粒载体并测序。目前，许多研究小组已经利用这种方法成功地从各个物种中克隆鉴定了大量的 miRNA。直接克隆方法最大的优点是精确确认 miRNA，能够区分开只差一个碱基的家族分子。
然而，直接克隆也存在着明显的局限性：一方面，由于文库的构建是一个长期的过程，且每个文库需要经过大量的测序反应才能获得足够的数据，耗时且低效；另一方面，由于部分 miRNA 的组织特异性以及低丰度表达，加之其它内源性非编码 RNA和 mRNA 的降解产物的干扰，该方法很难鉴定那些组织特异性低表达的或碱基构成特殊、存在转录后修饰的 miRNA。
但是，近年来高通量测序技术（如 454，Solid 和 Solexa 等测序平台）的突破极大的完善了该方法，其可以一次性产出百万级的高质量小分子 RNA 序列，能够从全基因组水平大范围地发掘已知和未知、保守和非保守的 miRNA，弥补了过去难于鉴定低丰度或组织特异性表达 miRNA缺点；同时可以构建样品间的小分子 RNA 差异表达谱，为小分子 RNA 的鉴定及功能研究提供了强有力的工具，从而在动植物 miRNA 及其他各种内源小分子RNA 的鉴定中得到越来越广泛的应用。
2 生物信息学预测
随着各生物全基因组测序的完成，生物信息学方法逐渐发展成为鉴定miRNA 的有力方法，这种方法可以弥补直接克隆法的一些不足，大大提高鉴定miRNA 的效率。生物信息学方法主要依据在不同的物种中，成熟的 miRNA 具有高度的序列同源性、前体的茎环结构具有较高的保守性、其结构和序列的热力学稳定性与已知 miRNA 具有相似性、其在基因组中往往成簇排列、以及其与靶基因序列的碱基互补配对模式具有保守性的这些特征，在基因组数据库中搜索新的miRNA 基因，它依赖于物种的基因组或转录组信息。
目前已有很多种针对不同物种设计的 miRNA 预测软件，算法各不相同，但都以 miRNA 的共有特征为标准进行预测。MiRscan 是第一个预测软件，它能特异识别 2 个物种间的同源序列。Lim 等于 2003 年利用它在 C.elegans 和 C.briggsae 中寻找到同源的发卡结构，通过与已知 miRNA 序列比对后，成功的预测出了线虫的 35 种新 miRNA。另一个预测软件 snarloop 已在线虫中预测出了 214 种 miRNA。RNAz 软件通过结合热力学稳定性和二级结构保守性来预测非编码 RNA。MiRseeker 软件则是根据 miRNA 前体二级结构的保守性、在相似的物种中成熟 miRNA 序列的保守性、在相距较远的物种间 miRNA 则具有一定的分歧的这 3 个特点设计完成的，利用该软件已经在人类和其他物种中预测出了 800 多种新 miRNA。
如在果蝇中Lai 等人利用该软件预测出 48 个 miRNA，其中 24 个已被实验验证。另外，也可以通过分析基因中潜在的靶序列倒推出 miRNA。Xie 等人比对了一些哺乳动物基因组 3′-UTR 保守序列中的共有序列，发现这些序列与一些已知的 miRNA 的5′种子序列（seed sequence）互补，并预测出了 129 种新的 miRNA。生物信息学预测的方法虽然已经发现了大量的 miRNA，但是由于其本质是根据少量的已知 miRNA 或 pre-miRNA 总结规律，去发现大量的新 miRNA。
然而目前已知miRNA 的数量较少，从中总结的规律不足以代表整个 miRNA 家族，因而使得生物信息学预测不可避免的会产生大量的假阳性数据。此外，该方法只能应用于拥有背景数据库的物种，没有基因组或转录组信息的物种无法预测，也难于预测物种特异的 miRNA，所以目前多数实验室结合了高通量的实验手段和计算机方法来鉴定更为广泛的 miRNA。
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