宁夏规模场奶牛新孢子虫病血清学调查

    摘 要：为了解宁夏奶牛新孢子虫感染情况，在宁夏奶牛养殖集中区随机抽取22个规模奶牛场，采集奶牛血清，利用新孢子虫病ELISA检测试剂盒进行检测，结果表明，调查场奶牛新孢子虫场群阳性率为34.69%，由高到低为利通区、银川市和青铜峡市；个体阳性率在3.94%～8.94%之间；感染牛群主要集中在3岁以上的奶牛群，1～3岁之间的次之，1岁以下的感染率最低。该区规模奶牛场新孢子虫感染较为普遍，药物治疗效果不明显，应当加强场区生物安全管理，强化动物疫病净化手段。

    奶牛新孢子虫病是由犬新孢子虫引起的一种家畜共患原虫病。其特征是造成孕畜流产、死胎、新生幼畜运动神经系统疾病。感染新孢子虫的奶牛体重和产奶量下降明显，淘汰期提前，经济损失严重。一般认为，该病主要通过胎盘感染和经口传播，这与新孢子虫虫株或分离物的传染能力和感染途径有关。在欧洲和美国75%～95%的犊牛主要是通过胎盘感染，而新西兰主要是经口传播。目前关于奶牛新孢子虫流行病学调查的报道较多，也曾有学者对宁夏部分奶牛场开展了相关研究，由于采样在少数规模场完成，且采样群体较为单一，不能完全反应宁夏地区奶牛新孢子虫流行情况。为进一步探明宁夏奶牛新孢子虫感染情况，对宁夏奶牛养殖集中区开展了血清学调查。

    1 材料与方法

    1.1 材料

    1.1.1 待检血清

    将银川市、吴忠市利通区、青铜峡市大于300头以上的牛场统一编号，按照预期流行率为5%，置信水平为95%（CI：95%）条件，利用简单随机方法选择规模牛场。被选牛场按照小于1岁、1～3岁，3岁以上群体进行采样，每场每种群体各采集10份血清样品。三个地区共采集47个规模奶牛场的1470份血清。

    1.1.2 试剂盒

    新孢子虫抗体ELISA检测试剂盒为西班牙HIPRA产品。

    1.1.3 主要仪器

    Eppendorf移液器、伯乐iMark酶标仪、恒温培养箱。

    1.2 方法

    1.2.1 检测方法

    按照试剂盒说明书操作。将血清样本按1∶100稀释后，在A1和A2孔中各加50μl的阳性对照，B1和B2孔中各加50μl的阴性对照，剩余孔中加入50μl稀释后的血清样品。封板，37℃孵育60min。每孔加300μL洗涤液洗涤3次。每孔加入100μl牛单克隆酶标抗体，37℃，孵育60min。重复洗板3次。每孔加入50μl底物溶液，轻轻摇匀，室温避光放置15min，每孔加入50μl的终止液，在酶标仪405nm处读取OD值。

    1.2.2 结果判定

    1.2.2.1 实验成立条件

    当阳性对照平均OD405大于0.9，阳性对照平均OD405/阴性对照平均OD405大于5.0，试验结果成立。

    1.2.2.2 通过计算，用IRPC值评价结果：

    IRPC=100×（样品OD450 - 阴性对照OD450平均值）/（阳性对照OD450平均值 - 阴性对照OD450平均值）

    1.2.2.3  结果判定

    若样品IRPC值≤6.0判为阴性；若6.0＜IRPC值≤10.0判为可疑；若IRPC值＞10.0判为阳性。

    2 结果

    2.1 不同地区奶牛新孢子虫感染结果

    检测的1470份奶牛血清样品中，共有103份新孢子虫抗体呈阳性，阳性率为7.01%；检测的49个规模奶牛场中，有17个规模牛场为阳性场。银川市、吴忠市利通区和青铜峡市奶牛新孢子虫个体阳性率分别为6.46%、8.94%和3.94%；场群流行率分别为31.25%、40.91%和27.27%（见表1）。

    2.2 不同年龄奶牛新孢子虫感染结果

    在不同的年龄分组，大于3岁的奶牛感染新孢子虫的阳性率最高，为12.86%，其次是1～3岁的奶牛，阳性率为7.14%，小于1岁的奶牛感染新孢子虫的阳性最低，为1.02%（见表2）。
    3 结论

    此次调查与已报道的其他国家和地区的牛新孢子虫个体阳性率相比较低（3.94%～8.94%）。其中罗马尼亚27.7%、巴西21.6%、西班牙24.1%，我国北京（18.1%）、河北（23.6%）、新疆（13.1%）、青海（11.42%）、吉林（17.3%）、广东（18.9%）、广西壮族自治区（15.07%）个体阳性率较高。2015年曹思婷等人对宁夏吴忠地区流产奶牛开展了牛隐孢子虫血清学调查，结果发现，受调查流产牛的阳性率为30.23%。其主要原因为大多数研究者主要将调查对象集中在流产牛的新孢子虫感染，而本调查没有特意针对流产牛开展调查，主要采用简单随机抽样方式进行抽样调查，更能反映宁夏奶牛新孢子虫感染情况。结果显示，受调查地区奶牛新孢子虫感染率由高到低为利通区（40.91%）、银川市（31.25%）和青铜峡市（27.27%）。此外调查结果的偏离与研究者所选用试剂和方法的敏感性和特异性有关。目前应用于新孢子虫的检测方法较多，常见有ELISA、荧光抗体试验、PCR、组织学检查、动物接种试验等，不同的方法可导致调查结果不同。

    对不同年龄奶牛新孢子虫感染调查发现，大于3岁的牛群感染临床较高，而小于1岁的牛群感染率最低。谭启东等人认为年龄与新孢子虫感染之间没有必然联系，但调查结果与本次结果一致。从感染途径上来看，本次调查说明宁夏奶牛感染主要以水平传播为主。

    迄今为止，尚未发现治疗奶牛新孢子虫病的特效药物。最有效的方法是对奶牛新孢子虫病开展流行病学调查和监测，采取疫病净化的方式，发现阳性畜及时淘汰，做好消毒和污染物的无害化处理工作，加强引种前检疫、隔离饲养，减少与携带病原的动物接触，切断传播途径。

   （李忠，赵燕，李杰，宋权儒，李知新  宁夏动物疾病预防控制中心）

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