禽流感新型疫苗研究进展

     摘　要：禽流感是由A型流感病毒引起的一种急性呼吸道传染病， 家禽、 野鸟和部分哺乳动物均可感染。禽流感给中国养殖业造成了巨大的损失， 同时， 随着病毒的种间传播， 人类的生命安全也受到了严重威胁。目前， 疫苗免疫仍是防控禽流感最主要的手段， 传统的疫苗主要有鸡胚灭活苗和禽流感弱毒疫苗。虽然在过往几次禽流感暴发过程中， 传统疫苗发挥了重要作用， 但其自身却存在诸多弊端， 因此研制新型疫苗来弥补传统疫苗的不足是很有必要的。文章主要对禽流感重组活载体疫苗、 基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗和病毒样颗粒疫苗等新型疫苗的研究进展进行综述， 旨在为禽流感的防控提供参考。

     禽流感（avianinf1uenza，AI） 是由A型流感病毒引起的一种禽类疾病综合征， 被世界动物卫生组织（OIE） 列为最危险的动物疫病之一，可在家禽\水禽、 野生鸟类和哺乳动物中广泛、迅速地传播。由于流感病毒本身极易发生变异， 且 HA 和 NA 的组合理论上有198种之多， 而机体内缺乏针对所有亚型和新型病毒的特异性抗体，造成了流感大流行的频繁发生。自从1878年首次报道禽流感以来， 在世界范围内广泛存在， 不仅给养殖业造成巨大的经济损失， 还给人类的生命安全带来了严重威胁。1997年在香港，人类第一次感染 H5N1 亚型禽流感病毒（ avianinf1uenza cirus，AIV） ，在确诊的18名感染者中， 有6人最终死亡。近年来，AIV 跨越种间障碍由动物感染人类的事件时有发生， 仅2013年就有3种新型 AIV突破种间屏障感染人类，分别是H7N9、H6N1 和 H10N8 亚 型 AIV。其 中， 感 染H7N9和H10N8亚型 AIV 后的死亡率分别约为20％和66％。

     目前， 疫苗接种仍是防控禽流感最有效的手段。传统的全病毒灭活疫苗早在50多年前就被批准使用， 而且在禽流感的防控中发挥了重要作用。但在世界范围内， 禽流感疫情仍然时有发生， 并导致易感动物的感染和死亡。AIV 的不断演化及新病毒的出现使现有疫苗的效力降低甚至失效。因此， 每年都要对疫苗进行更新使其能抵抗流行毒株引起的疫情。尽管如此， 仍然存在很多问题， 如疫苗效力低下、 在幼小动物和高龄动物中存在安全风险、接种剂量大等。且传统疫苗受制作工艺的限制， 免疫效力受保存和使用环境的影响， 接种后的副作用也会对疫苗的免疫效力产生不同程度的影响。因此， 研制新型禽流感疫苗， 加强对禽流感的防控， 一直是科研人员关注的焦点。作者就几种常见的禽流感新型疫苗进行综述， 旨在为禽流感的防控提供参考。

     1　重组活载体疫苗

     重组活载体疫苗是利用基因工程的方法， 将AIV 中具有免疫原性的基因片段整合至对禽类致病力较弱的病毒或细菌载体中制成的疫苗。抗原基因随着病毒或细菌在机体内的复制而持续表达， 从而诱导机体产生针对抗原蛋白的免疫应答。与传统的灭活疫苗相比， 重组活载体疫苗用量少，抗体持续时间长，且不需要添加佐剂，但其安全性还有待提高。

     目前， 使用最多的病毒载体主要有痘病毒、 腺病毒、 新城疫病毒和杆状病毒。其中， 痘病毒结构简单， 可容纳大片段外源基因并具有较高的表达效率， 因此得到了广泛应用。痘病毒作为疫苗载体首先应用于1982年， 科学家将疱疹病毒的胸苷激酶基因整合至牛痘病毒中并成功表达出具有功能的蛋白。1983年， 携带H2N2 亚型流感病毒HA基因的重组牛痘病毒构建成功， 该重组病毒可以在兔和仓鼠体内诱导产生免疫应答。随后， 流感病毒的10个主要蛋白在牛痘病毒中成功表达。但直到今天， 重组痘病毒疫苗仍只在兽医领域使用， 已批准使用的包括以鸡痘病毒和金丝雀痘病毒为载体的禽流感和马流感疫苗。表达AIV HA 基因的痘病毒载体疫苗除了可抵抗 AIV 的攻击以外， 还可对禽痘病毒感染提供保护。

     Qiao等构建了同时表达 H5N1 亚型 AIVHA和NA 基因的重组鸡痘病毒rFPV－HA－NA， 用该病毒免疫ＳPF鸡可对 H5N1 和 H7N1 亚型 AIV 提供完全保护。随后， 乔传玲对rFPV－HA－NA的最佳免疫剂量、 免疫日龄、 免疫产生时间等做了进一步测定， 结果发现约含100PFU的重组病毒就可对强毒感染提供完全保护， 对1日龄SPF鸡接种4周后能对强毒攻击提供完全保护， 重组病毒在免疫10个月后仍可对强毒攻击提供100％的保护力。2012年墨西哥暴发的H7N3亚型禽流感疫情中， 采用重组活载体疫苗和灭活苗共同免疫的方法， 使发病率和死亡率均显著降低。接种中采用的重组活载体疫苗来源于一株重组鸡痘病毒， 该病毒携带有低致病性禽流感Ｈ7基因。Ge等以新城疫病毒LaＳota株为骨架， 构建携带 H5N1 亚型 AIV HA基因的重组病毒， 该病毒接种鸡后能同时对速发型新城疫病毒和高致病性 AIV 提供保护。王伟构建了表达H5N1 亚型AIV HA基因的重组腺病毒，将该重组病毒以适当剂量免疫小鼠和ＳPF鸡后， 均可对致死剂量 H5N1 亚型 AIV 的攻击提供100％保护。

     2　基因工程亚单位疫苗

     禽流感亚单位疫苗是将 AIV 中具有免疫原性的基因通过真核或原核表达， 将表达的蛋白进行纯化后加入适当佐剂制备而成。亚单位疫苗本身不具有感染性， 因此有很高的安全性， 能刺激机体产生足够的免疫力。目前， 病毒主要保护性抗原 HA、NA和NP蛋白是禽流感亚单位疫苗的主要研究对象。其中， HA是构成 AIV 囊膜纤突的主要成分之一，是AIV 的一种表面糖蛋白， 可诱导机体产生体液免疫应答， 是AIV 抗原变异和病毒致病力的主要决定因素， 因此， 在禽流感基因工程亚单位疫苗的制备中被广泛使用。

     Liu等利用杆状病毒表达系统表达 H5N1 亚型AIV 的HA蛋白， 加入弗氏完全佐剂制成疫苗后免疫ＳPF 鸡、 商业用鸡和BALB／c 小鼠， 结果发现， 该疫苗可诱导产生抗体反应且对ＳBALB／c  鸡和商业用鸡提供完全保护， 以２μｇ的剂量免疫7日龄鸡两周后可产生保护性免疫， 血清抗体可持续6个月， 而免疫BALB／c 小鼠后同样可抵抗 AIV 的致死性攻击， 说明该疫苗具有成为控制禽类和哺乳动物流感候选 疫 苗 的 潜 力。Kodiha11i等研制的火鸡 H5N2 亚型AIV HA和NA复合亚单位疫苗免疫火鸡21ｄ后可产生较高的抗体滴度， 并且可检测到Ｔ细胞增殖和迟发型过敏反应， 说明该疫苗可诱导体液和细胞免疫应答， 而随后的攻毒试验结果表明， 该疫苗可以对同源和异源（ H6N1 ） 亚型 AIV 的攻击提供保护。李贺等利 用杆状病毒表 达系统 获 得 H7N1 亚型AIV HA蛋白后， 加入弗氏完全佐剂制成疫苗， 以20μｇ／羽的剂量免疫SPF鸡， 两周后进行加强免疫， 加强免疫两周后的攻毒试验结果表明该疫苗对同源AIV 攻击的保护率为100％， 攻毒后取咽拭子和泄殖腔拭子并未分离到病毒。张新涛等将H5N1 亚型 AIV 的M2e蛋白制成疫苗后免疫ＳBALB／c  鸡和BALB／c 小鼠， 攻毒后虽可对 AIV 的攻击提供一定的保护， 但保护率较低， 可能是因为与HA相比，M２e 的免疫原性较低。

     传统的亚单位疫苗通过分离免疫原性强的蛋白亚单位制备而成， 该方法操作复杂且成本较高， 制约了亚单位疫苗的大规模生产。随着基因工程和分子克隆技术的发展， 可将抗原基因连接到载体质粒， 随后借助于各种表达系统可获得大量具有免疫原性的蛋白亚单位， 从而实现基因工程亚单位疫苗的大规模生产。但由于大多亚单位疫苗提取的是单一的抗原蛋白， 诱导的免疫反应强度还有待提高， 这是今后的禽流感亚单位疫苗研究需要解决的问题。

     3DNA疫苗DNA疫苗又称为基因疫苗或核酸疫苗， 是依靠现代分子生物学技术发展而产生的一种新型疫苗。20多年前， 科学家证实， 直接注射可编码免疫相关基因的真核表达质 粒 即可 诱导 机 体 产 生 免 疫 应答。其原理是利用基因工程的方法将病毒的保护性抗原基因整合至真核表达质粒， 在靶细胞中， 抗原基因得以表达， 从而刺激机体产生特异性的体液和细胞免疫反应。相比于传统疫苗，DNA疫苗具有多个优点：①DNA疫苗更加安全、 稳定， 且生产成本低、 易于操作；②可同时诱导产生体液免疫和细胞免疫， 且抗体持续时间长 ③DNA疫苗具有热稳定性， 易于保存和运输；④将携带不同抗原基因的真核表达质粒混合可制成广谱疫苗， 抵抗多种病毒的感染；⑤DNA疫苗免疫只表达一种或几种抗原蛋白， 接种时没有潜在的感染风险。

     张强哲等构建了可表达 H５亚型 AIV HA基因的重组表达质粒PC4H5和PCMVH5， 采用电击法免疫小鼠和SPF鸡后， 均能对H5 亚型AIV的攻击提供完全保护。有研究认为， 流感病毒 HA、NA、M1、NP和NS1等基因均可用于DNA疫苗的生产，但多数采用 HA 基因。基于 M2e 基因的 DNA 疫苗诱导的免疫保护力虽然低于基于HA基因的DNA 疫苗， 但M2e基因具有在Ａ型流感病毒中高度保守的序列， 因此 M2eDNA疫苗有可能在广谱疫苗的研发中发挥重要作用。 据此，Park等构建了携带H1N1亚型AIV HA和 M2e 基因的融合质粒， 免疫动物后用 H5N2 亚型AIV进行攻毒试验。结果发现， 融合质粒可对 H5N2 亚型 AIV 的攻击提供完全保护， 且保护效果要高于只含有HA或M2e基因的质粒， 表明用融合质粒构建的疫苗具有交叉保护性。

     尽管与传统疫苗相比 DNA 疫苗具备诸多优点， 但曾经有报道指出， 肌肉注射免疫 DNA 疫苗在攻毒前并不能诱导产生可检测到的 HI 抗体，而在 CHen 等的研究中却得到了不一样的结果。其将一株 H5N1 亚型 AIV 的 HA 基因克隆至载体PCI上 构 建 了 疫 苗 质 粒PCIHA， 分 别 以100和50μｇ／羽的剂量肌肉注射免疫3周龄的ＳPF鸡， 一免两周后进行加强免疫， 加强免疫两周后以10LD50 进行攻毒试验。结果显示， 一免两周后的 HI抗体滴度分别为25.8±2.0和24.7±2.5，加强免疫两周后的 HI 抗体滴度分别为28.4±2.7和27.6±3.9， 攻毒一周后 HI 抗体滴度分别为29.6±2.2和29.0±2.4， 且攻毒后鸡不死亡、 不排毒、 无临床症状， 表明DNA疫苗可引起高水平的 HI抗体反应并诱导对致死性 AIV 攻击的完全保护。

     4　病毒样颗粒疫苗

     流感病毒血清型众多， 根据 HA 和NA抗原性上的差异， A型流感病毒又可进一步分为18个HA 亚型和11个NA 亚型， 这给禽流感疫苗的研发带来了巨大的困难， 病毒样颗粒（VLP） 疫苗为这一难题提供了解决办法。VLP是含有某种病毒一个或多个结构蛋白的颗粒， 具有完整病毒的免疫原性而不含病毒核酸， 因此可诱导产生免疫应答但不能自主复制。

     VLP疫苗具有诸多优势：① VLP疫苗不含病毒核酸， 在使用过程中不会发生病毒的基因重组， 因此具有很高的安全性；② VLP可被抗原递呈细胞捕获， 因此可诱导机体的细胞免疫；③VLP疫苗成本低， 生产周期短， 给疫苗的大规模生产提供便利；④ VLP可应用多种表达系统生产， 如杆状病毒表达系统、 大肠杆菌表达系统、 酵母表达系统和哺乳动物表达系统， 摆脱了传统疫苗对鸡胚的依赖， 保证了禽流感大流行时疫苗的供应；⑤ VLP疫苗更加稳定， 不易失活。上述优势使VLP疫苗成为近几年研究的热点。

     在上述VLP表达系统中， 应用最广的是杆状病毒表达系统。杆状病毒表达系统在表达外源蛋白方面具有明显优势， 易于筛选， 蛋白表达水平高， 成本低， 易于外源蛋白的大规模生产且具有很高的安全性， 更重要的是， 使用该系统表达的蛋白保持了原有的生物活性， 保留了原有的免疫活性。王立强等构建了能共表达 H5N1 亚型AIVHA、NA、M1和M２蛋白的杆状病毒， 并在昆虫细胞中组装成病毒样颗粒， 该VLP的形态与 AIV 一致且具有血凝活性。黄晓媛等对 H5N1 亚型禽流感VLP与全病毒灭活苗进行了体液免疫和细胞免疫的比较，免疫小鼠后发现，VLP和全病毒灭活苗均能使小鼠血清IgG效价升高且VLP免疫剂量达到200ng/只后可对病毒攻击提供完全保护，CD4＋T细胞和CD8+T细胞的比例较正常小鼠均升高且与免疫剂量呈正相关， 表明H5N1亚型AIVVLP可诱导机体的体液免疫和细胞免疫。Novavax公司于2005年利用Bac-to-Bac昆虫杆状病毒表达系统研制成含有H9N2亚 型AIVHA、NA、M1蛋白的VLPs疫苗， 经对比试验表明该疫苗具有很好的免疫原性和保护力，可作为流感大流行时的备选疫苗。

     5　结语

     进入21世纪以来， 全球范围内暴发了多起禽流感疫情， 对养殖业造成了极大的影响。不仅如此，AIV跨 越 种 间 障 碍 感 染 人 的 事 件 也 越 来 越 多。2013年暴发于中国的H7N9亚型禽流感在短时间内造成了132人感染、37人死亡的严重后果。由此可见， 防控禽流感不仅关系到养殖业的健康发展，更是与人类的生命安全息息相关。研制快速而有效的禽流感疫苗一直都是人们关注的焦点， 而除了疫苗本身以外， 制作疫苗过程中使用的佐剂、 疫苗的接种途径及其他可能影响免疫效果的因素同样值得关注， 只有达到最佳的组合才能获得最好的免疫效果，这样， 在面对禽流感疫情时才能更加从容。

     （河北远征药业有限公司   吕让，毛雅元，杨国辉，魏丽娟，贾国宾，魏永辉）

上一篇： 当前猪病流行动态与防控对策（上）

下一篇： 海南首笔罗非鱼养殖收入保险落地