肌肉生长抑制素基因（myostatin，MSTN）属于转化生长因子β家族，其主要功能是负向调控肌肉的生长发育［6］。不同饲养模式下猪群运动时间差异明显，进而影响猪群的生长发育，造成猪肉产量的差异，这种环境条件不同造成的差异是否影响猪内源性MSTN蛋白的表达尚无具体文献报道，因此该研究采用免疫组织化学的方法，对发酵床饲养模式及常规水泥地面饲养模式下的猪MSTN表达量的差异进行研究，分析不同饲养模式下的猪只运动量对MSTN表达量的影响，为猪肉品质调控的研究提供试验素材，同时对采取综合手段进行家畜生态健康养殖，减少畜禽粪便面源污染提供新途径。

    试验在江苏省农业科学院六合动物科学基地发酵床小区以及江苏省农业科学院六合动物科学基地试验猪场同时进行，试验时间为2013年6月3日—9月3日，选取120头60日龄仔猪随机平均分成发酵床饲养模式组与常规水泥地面饲养模式组。其中，常规水泥地面饲养模式组60头仔猪，分4个重复，每个重复15头仔猪（经方差分析LSD法比较，各重复间体重差异不显著）；发酵床饲养模式组60头仔猪，分4个重复，每个重复15头仔猪，重复间体重差异不显著。

    发酵床正试期前对试验猪进行常规免疫及编号等试验准备工作。饲喂方式均为自由采食与饮水，由同一饲养员负责饲喂清扫等工作。每天对发酵床内猪粪进行散粪处理，每周至少将发酵床表面均匀翻动1次。发酵床水分保持在45%～55%，确保发酵床正常发酵，并保持圈舍内光照充分，通风良好。常规饲养组猪舍每天干清粪2次，每周进行1次猪舍喷洒消毒。

    不同组别猪群预饲期统一定为7d。第8天开始作为正饲期第1天，称量试验猪体重，并将其作为正饲期初始体重，同时开始精确统计饲料消耗量。正饲期结束后空腹24h称重，并将其作为正饲期终末体重。统计正饲期间饲料消耗量与各组别的死亡情况。

    正饲期结束时，在发酵床饲养模式组（FB）与常规水泥地面饲养模式组（CB）各选择10头体重接近、公母各半试验猪，空腹24h后进行屠宰试验，取1cm×1cm臀肌放入固定液中充分固定后进行免疫组化试验。

    SP试剂盒（购自福州市迈新生物技术开发有限公司，货号：KIT9902）；苏木素染色液（购自福州市迈新生物技术开发有限公司）；正常羊血清（购自北京索莱宝科技开发公司）；中性树胶（购自福州市迈新生物技术开发有限公司）；多聚赖氨酸（购自福州市迈新生物技术开发有限公司，用蒸馏水配制成10%多聚赖氨酸）；二甲苯、甲醇、枸橼酸三钠等试剂（均为国产分析纯）；DAB［江苏省农业科学院畜牧研究所实验室自配，6mgDAB溶于10mLTBS缓冲液（0.05mol/L，pH值为7.4），再加入0.1mL3%H2O2，新华滤纸过滤去除沉淀物即可，30min内使用完］；0.01mol/LPBS（Na2HPO4·12H2O29.02g，NaH2PO4·2H2O2.96g，NaCl85g，加双蒸水至1000mL，调pH值至7.2，即成10×PBS），临用时用蒸馏水稀释成1×PBS；柠檬酸盐抗原修复缓冲液［1000mL蒸馏水中加入枸橼酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g，枸橼酸（C6H8O7·H2O）0.4g，溶解后调pH值至6.0］。

    切片机（美国ReichertHistoSTAT）；孵箱（苏州净化设备有限公司）；烤箱（美的集团股份有限公司）；冰箱（青岛海尔股份有限公司）；显微镜（日本OLYMPUS）；天平（上海天平仪器厂）；耐高温塑料染色架（福州市迈新生物技术开发有限公司）；免疫组化染色孵育盒（自制）；磨砂玻片（清洗后用10%多聚赖氨酸处理5min，烤干备用）。

    组织固定：在脱蜡之前，将切片置于60℃恒温箱中烘烤60min；脱蜡：将切片用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；水化：分别在无水乙醇中浸泡5min，95%乙醇中浸泡5min，85%乙醇中浸泡5min，70%乙醇中浸泡5min；洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次；抗原修复：将放有切片的耐高温塑料染色架放入盛有抗原修复缓冲液的烧杯中，煮沸，保持微沸状态20min，而后将烧杯浸入流水中（不可将玻片从缓冲液中取出冷却），自然冷却；洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次；灭活酶：3%H2O2-甲醇溶液处理切片15min；洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次。

    加一抗：加入一抗（1∶100）100μL，37℃，湿盒孵育2h。洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次。加增强剂：加入增强剂50μL，室温湿盒孵育20min。洗涤：PBS浸泡5min，清洗3次。加酶标二抗：加入HRP标记二抗50μL，室温37℃，孵育30min。洗涤：PBS浸泡5min，清洗5次。DAB法显色：每张片子加2滴新鲜配制的DAB溶液。终止显色：镜下观察染色深浅，染好后立即中止，用自来水轻柔冲洗15min，用蒸馏水终止显色反应。复染：将切片放入苏木素染液，染色30min，用蒸馏水冲洗干净。封片：放入盐酸甲醇溶液中，立即用蒸馏水冲洗干净；分别在70%中浸泡5min，85%乙醇中浸泡5min，95%乙醇中浸泡5min，无水乙醇中浸泡5min；用二甲苯浸泡10min，更换二甲苯后再浸泡10min；晾干后加盖玻片。观察：光学显微镜。

    猪只运动状态可通过24h高清摄像头监控获得，并将1d时间分割为1440min。其中，猪只运动状态包括：行走、追逐、打斗、探究；静止状态包括：站立、躺卧。采用颜色标记的方式，试验组与对照组各选择10只，通过每周选取1d，每天选取2个时间段（8：00—10：00；14：00—16：00），连续监测3个月的方式观察获得，试验结果以x±s表示，用SPSS14.0统计软件分析。免疫组化相对定量分析采取Image-ProPlus灰度分析功能获得相对灰度值，图形采用GraphPadPrism5.0统计分析获得。

    由图1可知，在发酵床饲养模式组中，猪只运动时间（行走、追逐、打斗、探究）占总时间比率较常规水泥地面饲养模式组显著增加82.60%（P<0.05）。

    

    由表1可知，发酵床饲养模式与常规水泥地面饲养模式效果相比，平均增重与平均日增重分别提高10.50%与11.72%，差异显著（P<0.05），据此分析采用发酵床养猪模式，显著提高了猪只增重效果。

   

     就某一动物而言，肌纤维数量是恒定的，但可以通过运动等方式改变肌纤维直径，从而增加和改善肉品质量。如图2所示，发酵床饲养模式下，由于猪群运动空间增加，相对于水泥地面饲养模式，猪群的活动范围增大，猪体运动时间增加，运动量提高，如图2中箭头所示，FB条件下猪臀部肌纤维束变粗，且与CB相比，肌纤维直径增加4.9%（P>0.05），后腿臀部肌纤维束变粗，肌纤维更加饱满。图3所示免疫组化结果为猪臀肌纵切面肌纤维剖面图2组别为臀肌同一部位，箭头所指部位为内源性MSTN蛋白在臀肌中的阳性表达部位。图4为不同组别MSTN蛋白阳性细胞差异，通过Image-ProPlus灰度分析功能对阳性表达的灰度值进行相对定量分析，发现在常规水泥地面饲养模式组（CB）猪臀肌中的阳性比例较高，在发酵床饲养模式组（FB）猪臀肌中内源性MSTN蛋白显著减少（P<0.05）。

     

    该试验研究了发酵床饲养模式以及常规水泥地面饲养模式下，猪群运动时间差异，以及由该差异造成的对猪生产性能、肌纤维形态、MSTN蛋白表达影响，通过采用发酵床饲养模式后，猪群的运动时间明显增加，该饲养模式的改变可引起猪群生活方式的变化，产生了对生产性能与肌肉发育相关调控基因等一系列的改变。

    与常规水泥地面饲养方式相比，发酵床饲养模式下的猪肌纤维直径增加4.90%，肌纤维更加饱满，造成这一差异的原因可能是在发酵床饲养模式下，猪群活动空间增大，运动量增加，运动时间延长，肌肉细胞内容物质增加使得肌纤维直径增大，提示饲养环境改变对肌纤维直径的影响可能是通过MSTN表达量降低来实现的，MSTN作为肌肉肥大的负反馈因子来发挥其功能［7-8］。

    国内外学者［9-13］亦有阐述环境因素改变动物体MSTN表达的研究报道，胡骏鹏［14］、Guernec［15］、闫俊书［16］等从遗传以外的营养角度分析可能影响内源性MSTN表达的因素，认为饲料营养水平也是影响动物体内MSTN表达的重要因子。该试验免疫组化结果分析发现，起生物学功能的MSTN蛋白表达量显著降低，据此推断饲养环境的变化可能降低MSTN蛋白的表达量，MSTN蛋白抑制作用减小，猪群增重明显，这与表1所述的生产性能增重情况相对应。

    相关研究已表明，MSTN是在骨骼肌中广泛表达的糖蛋白，其表达量和功能的变化可能会通过调节靶基因的表达来改变肌肉的纤维组成及造成肌肉重量的变化［17-18］。体育训练过程中Laurentino等［19］研究发现不同强度的力量训练对MSTN表达有影响。80%1RM强度的力量训练与20%1RM强度的力量训练降低MSTN表达的水平分别为45%和41%，说明力量训练强度越大，降低MSTN的效果也越好，该次试验与Laurentino的研究发现相似，在2组不同的饲养模式下，由于发酵床饲养模式一定程度上增加了猪群的运动空间，相对应的猪群的运动时间也大幅提升，因此，在对猪内源性MSTN蛋白检测过程中都发现MSTN蛋白表达量降低的现象。

（江苏省农业科学院畜牧研究所，潘孝青，杨杰，徐小波，秦枫，刘蓓一，朱洪龙，李健，宦海琳，李晟，邵乐，张霞，顾洪如）