近30年来人们研制了各种猪的冻精稀释液。一般来说，各种稀释液都含有糖、蛋白和脂蛋白、缓冲液、添加剂及冷冻保护剂。根据其成分可以分为两大类:第一类是不含缓冲液的稀释液，例如卵黄—葡萄糖、卵黄—乳糖、卵黄—蔗糖－EDTA－Mg－Ca溶液;第二类为含缓冲液的稀释液，例如氨基乙酸—磷酸盐和葡萄糖—磷酸盐、卵黄—葡萄糖—柠檬酸、BeltsvilleF3(BF3)、BeltsvleF5(BF5)、Tes－tris—果糖—柠檬酸—卵黄(TEST)、Tes－NaK—果糖—卵黄、Tris—果糖—EDTA—卵黄、Tris—果糖—EDTA—卵黄等。

     如果进行两步稀释时，含甘油的稀释液可在将精液降温到5℃时加入。

     稀释液的成分虽然差别很大，但其共有的特点是甘油浓度低，平衡时间短。甘油与精子接触时间的长短对精子经受冷冻解冻的能力没有明显影响。目前，大多是在冷冻前任何时间均可加入甘油，加入后甘油能很快被吸收而进入精子。

     虽然人们对许多冷冻保护剂的效果进行了研究，但对猪的精子而言仍以甘油的效果最好。其他效果较好的保护剂还有木糖醇、核糖醇、乙酰胺和DMSO，这些物质在浓度较低时能提高精子解冻后的活力，但顶体完整的精子数减少。因此，目前甘油仍是猪冷冻精液最常用的冷冻保护剂。只是猪精子对甘油最为敏感，其在冷冻保存猪精子时的最佳浓度受许多因素的影响，例如冷冻速度等。一般情况下，甘油的浓度均较低，如果浓度过高，虽然能有效保护精子，但精子的受精能力会降低，也会损伤顶体膜，改变膜的通透性。

     目前冷冻猪精液的方法基本有两种，即Beltsville法和Westendorf法。前者是将富含精子的部分采集后与精清持留2h，然后离心，降温3h后在干冰上制成0.15～0.20mL的颗粒冻精。后一种方法是将精液按1∶2稀释，然后在Hulsenberg8稀释液中降温，最后制备成细管冻精。后来，人们根据研究结果对细管冻精进行了改进，如2mL的细管冻精、5mL的塑料袋等剂型，但在生产中仍未能广泛普及。

     甘油的冷冻保护效果受许多因素的影响。其一是降温速度。当含精子的悬浮液降温到溶液的冰点以下时，精子和溶剂会出现超冷，最后形成冰晶，当膜系统阻止冰晶膨胀时精子内容物并未冷冻。随着温度的降低，超冷的细胞水分对增加的渗透压发生反应，扩散出细胞而结冻。外渗的速度受细胞膜通透性的影响，特别是膜对水分和甘油通透性的影响，也受细胞大小和细胞表面积比例的影响。这种影响在一定程度上可以通过调节冷冻速度和冷冻保护剂浓度得到改善，如果冷冻速度很慢，则精子通过脱水而避免了细胞内结冰。如果精子冷冻过快，则细胞内的水分因不能外渗而结冰。根据这种双因素理论，精子细胞受损主要来自两个方面:其一是由于冷冻速度不适宜而引起脱水，这称为溶液效应，主要是由于细胞与高浓度的溶剂发生反应，因此pH发生变化;其二是由于精子冷冻过快而引起细胞内结冰。

     对甘油浓度和冷冻速度对精子活力的影响进行的研究表明，如果降低甘油浓度则应加速冷冻速度。就精子活力而言，最佳甘油浓度为3%～4%，对最佳的顶体完整性(NAR)而言，最佳浓度为0～1%。对这两个参数而言，最佳的冷冻速度为30℃/min。据此有人建议，冷冻猪精子时甘油浓度为3%，冷冻速度为30℃/min。甘油浓度超过6%时会明显引起顶体损伤，这种作用可能是由于化学毒性或渗透压变化所引起。

     快速冷冻过程中精子质膜脂类的组成及组织也会发生明显的改变，可使膜的通透性增加。许多研究表明，冷冻解冻的精子会出现类似于获能的变化，精子通过流式细胞仪筛选时也会出现这些变化。

     通过关键温区解冻精子的速度是影响精子存活的另一个极为重要的因素。尽管制成细管冻精的越来越多，但猪的精液大多数是在干冰上制成颗粒冻精。颗粒冻精一般在预热的溶液中解冻时由于加热速度快，因此效果较好。解冻效果与冷冻速度有密切关系，对精子的存活有显著的影响。如果冷冻速度适宜，则随着解冻速度的加快，精子活力和顶体完整率增加。快速解冻颗粒冻精时效果也很好，说明精子快速冷冻后的冷冻损伤主要是由于慢速解冻时小冰晶向外生长所引起。解冻速度对顶体完整率的影响也受甘油浓度的影响，浓度高时对顶体的完整性影响更大。目前的研究表明，要获得最高的活力和顶体完整率，猪精液冷冻稀释液的甘油浓度应为3%，在0℃～－50℃时的冷冻速度应该为30℃/min，解冻速度为1200℃/min。

     快速解冻时的最终温度对精子的存活也有明显影响，如果猪的精子在5～37℃快速解冻，会损伤顶体质膜，但不会引起酶的外泻及降低精子活力，这种所谓的“热休克”也受温度范围的影响。

     20世纪70年代以前大多采用手术方法将精液输入到输卵管，因此效果较差。1971年才通过子宫颈输入冻精获得产仔。目前的研究表明，冷冻精液的产仔率可达到50%，每窝可产7仔。荷兰对颗粒冻精一次输精和鲜精一次输精效果进行比较，其产仔率和窝产仔数分别为47%、7.4和79%、10.6，而且结果在品种间还有明显差别。研究结果显示，颗粒冻精和细管冻精的产仔率和窝产仔数分别为55%、8.3和58%、9.0。目前在采用冻精输精时，第1次是在检查到发情后30h，第2次是在10～12h之后。

(哈尔滨市动物卫生防疫站，白济豪）