粗蛋白质是饲料中最重要的营养物质，也是配合饲料中成本较高的组分，其测定结果的准确性影响饲料的选择、配方计算、产品质量等核心问题。因此，粗蛋白质的检测是所有饲料企业必须进行的检测指标，其准确的测定方法是影响饲料品质判别的关键环节［1］，因此蛋白质含量的测定在生产实践中有着重要的意义。目前，对于饲料蛋白质含量测定的方法有很多，如双缩脲法［2］、Folin酚法［3］、考马斯亮蓝法［4］、紫外吸收法、染料结合法、水杨酸比色法等，但就方法的准确性、精密度以及应用程度而言，国际经典测定方法———凯氏定氮法为首选［2］。但在应用国标检测方法时，消化后的样品冷却后经常出现大量结晶，影响后续消化液的准确转移和定容，而五水硫酸铜和无水硫酸钠是蛋白质检测中的催化剂，也是引起结晶的直接因素，因此试验研究不同催化剂添加量对饲料粗蛋白质检测过程及结果的影响，为饲料中粗蛋白质的测定提供更适宜的检测方法。

     饲料样品为苜蓿、玉米、豆粕。五水硫酸铜、无水硫酸钠、浓硫酸、硼酸、氢氧化钠、盐酸等试剂，均为国药分析纯。消化炉(型号为KDN－020D)、消化管、凯式蒸馏装置，均由内蒙古农业大学动物科学学院提供。

     试验过程参考半微量凯氏定氮法［3］，选用苜蓿、玉米、豆粕3种饲料，由于是无水硫酸钠与五水硫酸铜2个因素，设定每个因素为3个水平，每种饲料分为9个处理，每个处理设3个重复(见表1)。每个处理分别添加不同量的五水硫酸铜和无水硫酸钠，通过消化蒸馏观察现象，并得出数据。其他试剂添加量及试验过程均相同，试验过程中准确记录试验现象及结果，并统计数据。试验处理及分组，见表1。

   

     用差减法在分析天平上称取约0．5g的被测样品倒于消化管底部，并分别按照上述处理向消化管中加入无水硫酸钠和五水硫酸铜，然后用量筒慢慢加入浓硫酸15mL。将消化管放在消化炉上加热，先小火加热，当泡沫停止产生时再加强火力，使之维持微沸状态，温度保持在420℃左右。加热消化时应不时转动消化管，使硫酸能冲洗附着于瓶壁上的样品，缩短消化时间，直至瓶内溶液透亮清彻为止，即消化完毕。

     2．3氨的蒸馏

     采用半微量水蒸气蒸馏法将试样消煮液冷却，加纯化水20mL，然后将消化管中的消煮液用漏斗无损失地转移至200mL容量瓶中，冷却后用水稀释至刻度，摇匀，作为试样分解液。用量筒取20g/L硼酸溶液25mL置于锥形瓶中，加混合指示剂2滴，置于蒸馏装置冷凝管下，使管口浸入硼酸溶液中。用移液管移取试样分解液10mL，注入蒸馏装置的反应室中，用少量纯化水冲洗进样入口，再加400g/L氢氧化钠溶液10mL，用少量纯化水冲洗进样入口，将玻璃塞塞好，并且在入口处加水封好，防止漏气，蒸馏5min。使锥形瓶离开冷凝管，用纯化水冲洗冷凝管末端，洗液均流入锥形瓶内，然后停止蒸馏。

     2．4滴定

     用盐酸标准滴定溶液进行滴定，溶液变为灰紫色为滴定终点。

     2．5结果计算

     粗蛋白质含量(%)=V×C×0．014×6．25×V1V2×A×100%［4］。式中:C为盐酸标准滴定溶液浓度(mol/L);A为试样质量(g);V为滴定试样时所需盐酸标准滴定溶液体积(mL);V1为试样分解液总体积(mL);V2为蒸馏用试样分解液体积(mL)。每个试样取2个平行样进行测定，以其算术平均值为最终结果。

     2．6数据的统计分析

     对试验数据采用Excel进行初步处理，然后用SAS9．0软件进行统计分析，并对试验数据进行ANOVA方差分析和Duncan’s多重比较，结果均以平均值±标准差表示。

     由表2可知，A因素、B因素、A×B因素的P值均大于0．05，说明五水硫酸铜添加量、无水硫酸钠添加量、五水硫酸铜与无水硫酸钠的交互作用对粗蛋白质含量测定的结果均无显著影响(P＞0．05)。

     由表3可知，当五水硫酸铜添加量相同，无水硫酸钠添加含量不同时，消化液冷却后结晶量逐次增加，说明无水硫酸钠添加量对消化液冷却后结晶状态有影响。当无水硫酸钠添加量相同、五水硫酸铜添加含量不同时，消化液冷却后结晶状态相同，说明五水硫酸铜添加量对结晶状态无影响。

     

     由表4可知，五水硫酸铜添加量相同，随着无水硫酸钠添加量的增加，消化时间缩短，但无水硫酸钠添加量为4g和6g时，时间相差较少(0．5h以内)。当无水硫酸钠添加量相同时，添加五水硫酸铜0．3g和0．4g，消化时间基本一致。

     

     饲料中粗蛋白质的检测是实验室必须检测的项目，也是最主要的检测指标，数量大、任务重，因此要求检测方法准确、方便。针对生产实践中常用饲料粗蛋白质含量通常在7%～50%范围内，试验选择了有代表性的玉米、豆粕、苜蓿3种饲料原料进行检测。试验结果表明，饲料粗蛋白质含量未受五水硫酸铜及无水硫酸钠的影响，为消化时间和试验现象的确定提供了基本保证。黄晓东［5］研究表明，硫酸铜∶无水硫酸钾(或无水硫酸钠)主要有1∶9、1∶10、1∶15、1∶17的比例，国家标准为五水硫酸铜(0．4g)∶无水硫酸钾或无水硫酸钠(6g)的比例为1∶12。若无水硫酸钠的比例加大，则消化液易结块不易转移;若五水硫酸铜添加量减少，则消化时间加长或者消化不完全。这一现象在本试验中得到充分验证。

     硫酸钠的作用是提高浓硫酸的沸点，使消化效力提高。纯硫酸的沸点为317℃，加入无水硫酸钠后，硫酸沸点可增至325～341℃［6］。Na2SO4+H2SO4→2NaHSO4，2NaHSO4→Na2SO4+H2O+SO3。在消化过程中，随着硫酸的不断分解，水分不断蒸发，无水硫酸钠的浓度逐渐增大，则沸点升高，加速了对有机物的分解作用。因此，试验中当无水硫酸钠添加量为6g时消化时间明显提高，但结晶也非常明显。

     五水硫酸铜在反应过程中作为催化剂，王雅［7］认为，试验中五水硫酸铜的用量对消化时间有主要影响，浓硫酸和硫酸钠的用量为第二和第三因素。硫酸铜除了具有催化作用外，也可在下一步蒸馏时作为碱性反应的指示剂。消化后溶液的颜色为蓝绿色，这是催化剂中硫酸铜的颜色［8－9］。从试验的结晶状况来看，未受五水硫酸铜添加剂量的影响，但在消化时间上，添加五水硫酸铜0．2g的试验组消化时间较长。

     利用半微量凯氏定氮法检测饲料中粗蛋白质含量时，五水硫酸铜和无水硫酸钠的添加量对试验结果没有影响。无水硫酸钠的添加量越多，消化液的结晶越多。综合消化时间和消化液的结晶量表明，添加五水硫酸铜0．3g和无水硫酸钠4g作为催化剂效果较好。

(内蒙古农业大学动物科学学院，李敏，杨书伟，王海荣）