副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，Hps)可以引起副猪嗜血杆菌病。患病猪有纤维素性浆膜炎、脑膜炎和多发性关节炎等临床特征。近几年来，世界各地均有发生副猪嗜血杆菌病的报道，并且发病率呈上升的趋势，已经成为一个全球性的重要猪病[1]。

     伴随我国养猪业的快速发展，该病的流行越来越广泛，已经成为呼吸道疾病综合症中的重要疾病，对猪的危害日趋严重，对养猪业造成了巨大的经济损失。快速、准确地诊断出该病以便采取相应的措施，是成功防治该病的关键。本文介绍了副猪嗜血杆菌病诊断方法研究的一些新进展。

     根据病程的经过，大致可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型和隐性型5种类型，但所有这些类型可随条件的变动而互相转变，不能截然区分。最急性型：可表现为无症状突然死亡。急性型：多发生于膘肥体壮的猪。病猪体温升高，最高到42℃，精神萎靡，反应慢，吃得少；鼻塞，气喘，咳嗽，打喷嚏，有的出现呈腹式呼吸；心跳比正常快很多，耳梢呈紫色；鼻孔有粘液性及浆液性分泌物，以2～3声短促咳嗽为特征；眼睑周围皮下水肿，眼结膜潮红，皮肤和可视黏膜苍白，呈贫血状；出现跛行或一侧性跛行，腕关节、跗关节肿大，共济失调；临死前侧卧或四肢呈划水样。发病2～3d后死亡，也有的病例无明显症状而死亡。急性型病例如果存活可留下后遗症，即母猪流产，公猪发生慢性跛行，仔猪和育肥猪可遗留呼吸道症状和神经症状。亚急性型：保育猪的发病率很高，但主要有食欲下降、呼吸困难、发热等不典型症状；耐过的猪表现为营养不好，全身发白，严重的可能死亡。慢性型：通常由急性型转化而来，多见于生长和青年猪。主要表现为消瘦虚弱，被毛粗乱无光，皮肤苍白，精神沉郁，食欲下降，体温升高，短促咳嗽，腹式呼吸，关节肿大，卧地不愿起立，生长发育不良，甚至衰竭而死亡。隐性感染猪不表现症状，但同慢性型猪一样为带菌猪，易传染给其他健康猪。

     剖检病死猪，可见胸腔出现纤维素性胸膜炎，腔内存在大量的淡红色液体及纤维素性渗出物凝块；腹腔内有多量透明黄褐色渗出液，有的呈胶胨状凝块。心包炎，心包积液，心包内有奶酪样或豆腐渣样渗出物，使外膜与心脏粘连在一起，形成“绒化心”；心肌有时有出血点。全身淋巴结肿大，呈暗红色，切面呈大理石样花纹；关节肿大，关节腔内有浆液性渗出性炎症，有不等量的黄色或淡红色液体，有的呈胶冻样。肺脏呈纤维素性胸膜肺炎，肺呈暗紫红色，臌胀，有纤维素性渗出物覆盖在肺表面，有的肺与胸腔的侧壁粘在一起；支气管内有黄白色或淡红色泡沫样渗出物；肺间质灰白色到血样，胶冻样水肿是本病主要特征性病理变化之一。脾脏肿大，呈暗红色。肝脏肿大，表面有灰白色小坏死灶。肾脏肿大有少量出血点，肾盂有淤泥状物沉积。关节囊内有黏脓性红色渗出物，关节囊壁充血、出血、水肿。

     酶联免疫吸附检测方法又称为ELISA检测方法。该方法操作简单，时间短，具有很高的敏感性，可用于大批量的抗原或抗体样品的检测。王艳等[2]选用全菌作为包被抗原建立了Hps抗体间接ELISA方法，具有较好的试验效果。石碧等[3]提取了1株Hps细菌的荚膜多糖(CPS)，并以其为抗原分别建立了间接ELISA和间接血凝试验(IHA)两种抗体诊断技术。两种检测方法均有很好的特异性，但ELISA是IHA检测方法敏感性的5～10倍。冯小明等[4]将Hps菌体超声裂解，取上清作ELISA包被抗原，建立了Hps抗体间接ELISA方法。陈善真等[5]利用表达纯化的Hps外膜蛋白P5建立了Hps抗体间接ELISA检测方法。贾爱卿等[6]将Hps的外膜蛋白ompP2基因插入表达载体pET-32a，转化BL21进行诱导表达，以纯化的ompP2蛋白作抗原，建立了间接ELISA方法。郑念广等[7]对Hps４、５型耐热蛋白进行121℃高压处理后混合作为抗原，建立了Hps间接ELISA检测方法。李鹏等[8]将HpsP2蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-P2，在IPTG的诱导下成功表达了可溶性融合蛋白P2-His；利用纯化融合蛋白为抗原，建立了抗HpsP2蛋白抗体的间接ELISA方法（P2-ELISA）。李淼等[9]将重组表达的OmpP2纯化后做为抗原，建立了Hps间接ELISA方法。

     3.2PCR方法

     PCR方法是实验室常用的分子生物学诊断方法，因其检测的灵敏度高、特异性强、快速、简便等优点，在副猪嗜血杆菌病的诊断上得到了广泛的应用。

     林雪玲等[10]根据GenBank公布的Hps基因组序列，设计3对引物，提取分离的Hps菌株基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，结果3对引物分别扩增出822bp、824bp和1.9kb的目的条带。该方法适用性强，并且有很高的特异性和敏感性，既能对初代分离培养物中Hps进行鉴定，又可直接对病料进行PCR检测，适合基层应用。尹秀凤等[11]以Hps疑似自然感染仔猪肺和人工感染发病仔猪组织为病料，做PCR检测，同时结合细菌分离培养。结果显示，先对肺脏组织等病料进行细菌分离、培养，再用建立PCR法对分离菌进行鉴定，可准确诊断Hps。周勇岐等[12]针对Hps的16SrRNA基因设计引物，以提取的Hps基因组DNA为模板，建立了HpsPCR检测方法。该方法可以有效区分与Hps同源性较高的细菌，如：胸膜肺炎放线杆菌和副鸡嗜血杆菌等。张盼锋等[13]针对Hps16SrRNA基因特异性PCR引物序列，合成1对PCR引物，建立相应的PCR检测方法。结果显示可检测出浓度为2.8×103CFU/mL的Hps，表明该方法灵敏度高；对大肠杆菌、链球菌、巴氏杆菌、沙门氏杆菌、金黄色葡萄球菌进行PCR扩增均不获得任何条带，表明该方法特异性较强。所以该方法对于临床快速检测Hps具有重要意义。万世平等[14]设计了1对针对Hps16SrRNA基因的引物，建立了能特异性检测Hps的PCR检测方法。对传染性胸膜肺炎放线杆菌、巴氏杆菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌等均无交叉反应，扩增的目的条带的大小为821bp。李鹏等[15]设计了能扩增HpsOMPP2基因的1080bp片段的引物，并证明用该法可有效地鉴定或诊断Hps。这种PCR的敏感性达到了1000个Hps。刘建奎等[16]针对Hps16SrRNA序列设计1对特异性引物，建立了快速准确鉴定Hps的PCR方法，临床试验证明该方法具有很好的特异性和敏感性。

     实时荧光定量PCR（real-timefluorescencequantitativep-olymerasechainreaction，FQ-PCR）检测是一种新的技术，它是将光谱技术和PCR技术相结合的一种核酸定量检测技术，与常规PCR方法比有很多优点，如反应时间短，扩增产物不需用琼脂糖凝胶电泳检测，全封闭反应，更高的检测特异性与敏感性。

     于江等[17]建立了HpsSYBRGreenI荧光定量PCR检测方法，建立的检测方法不与其它猪源性病原菌发生交叉反应，有很好的特异性，敏感性是常规PCR的100倍，批内、批间重复试验变异系数均不大于2.5%，稳定性好。李军等[18]建立了一样快速定量检测Hps的实时荧光PCR方法，特异性强，重复性好，变异系数均小于2%，检测的最低限度是50拷贝/μL。苗立中等[19]建立了HpsSYBR-GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。建立了标准曲线，线性关系在102～108copies/μL非常好；敏感性为10copies/μL，是常规PCR的100倍；变异系数均不大于2.5％，并且对Hps检测的特异性很好。李富祥等[20]根据Hps16SrRNA基因的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针，建立了HpsTaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法与巴氏杆菌、沙门氏菌、乳杆菌链球菌、肠球菌、葡萄球菌、猪肺炎支原体等很多细菌无交叉反应；标准品浓度在6.92×108～6.92×103copies/μL范围内具有良好的线性关系，最低可检测到6.92×101copies/μL的标准品阳性质粒；批内和批间变异系数均小于3％。临床样品检测结果表明，该方法具有敏感性高、特异性好、稳定性强和快速的优点，可用于Hps感染的早期诊断和流行病学调查以及Hps的定量分析。

     3.2.3环介导等温扩增检测技术

     环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplifica-tion，LAMP)技术是一种核酸等温扩增技术，具有操作简单、成本低、检测效率高等特点，非常适合在现场和基层部门应用。吴诗敏等[21]根据Hps16SrRNA基因设计引物，使用Bst大片段聚合酶，以提取的细菌基因组DNA为模板进行等温扩增。结果表明：建立的方法能在65min完成检测全过程，检测到HpsDNA的最小量为0.2pg，是常规PCR的1000倍。朱杰仪等[22]建立的Hps环介导等温扩增方法，显示在63℃时反应的特异性强，检测敏感性是常规PCR的100倍。车勇良等[23]建立了Hps可视化LAMP检测方法，在55℃水浴1h即可对Hps基因组DNA进行扩增，在反应后的体系中加入SYBRGreenⅠ，即可对结果直接观察做出判断。该方法具有很强的特异性，其对DNA核酸的最低检测限为40fg，是常规PCR检测最低限的100倍，显示出较高的敏感性。用建立的LAMP方法对8株不同血清型Hps进行检测，结果均为阳性。

     副猪嗜血杆菌病快速敏感的检测技术不仅对于及时采取措施防控疫情蔓延等至关重要，还能及早发现新菌株，找出最危险的病原菌并开发相关疫苗，在防控疫情时掌握主动。用于诊断副猪嗜血杆菌病的方法有很多，其中有适合临床大批量血清检测的ELISA方法，ELISA具有操作步骤简单、敏感性高和特异性好等很多优点。但是ELISA方法受自身抗体干扰，易出现假阳性。实时荧光定量敏感性比常规PCR高100倍，但对操作人员要求高，且仪器价格高，一般的实验室都没有足够的资金购买，试剂的价格又很昂贵，因此不适合大规模推广应用。LAMP方法检测快速、简便，适合在基层兽医和养殖场进行推广使用，对指导副猪嗜血杆菌病的防控具有重要的意义，但LAMP方法灵敏度高易导致假阳性。随着分子生物学的发展，相信一些新型诊断方法终将问世并得以推广应用，使人们能更快速、准确地诊断副猪嗜血杆菌病。

（1.山东绿都生物科技有限公司，沈志强，苗立中，李书光；2.山东省滨州畜牧兽医研究院，于新友，李天芝，沈志强）