在样品测试之前如何选择合适的方法，通常优先选择国际标准和国家标准方法。对于非标准方法、企标方法和超出预定范围（如食品检测的方法来测试饲料样品）使用的方法，实验室不能够再现标准方法或方法采用偏离时都需要对方法进行验证，即进行方法性能检验，证明所选方法符合分析要求并满足客户的要求。

     方法验证通常主要考虑标准曲线、检出限、定量限、精密度和准确度等几个方面。

     1.1标准曲线

     采用仪器对方法进行检验时，首先要建立样品和仪器之间的关系。通常采用标准曲线来表示，利用不少于5点（不包括原点）的实验数据算出待测物和仪器响应值之间的线性回归方程并计算相关系数（r）：以待测物的绝对量（如μg）或浓度（如μg/mL）为横坐标，响应值（吸光度或荧光强度）为纵坐标制作标准曲线，确定线性范围，线性相关系数应该大于0.9990。本实验室要求原子吸收火焰法r>0.9990，石墨炉法r>0.9950，原子荧光光度法r>0.9990。

     在做方法验证之前，我们首先得知道样品中重金属元素的限度（如蛋鸡浓缩饲料中铅的限度为13mg/kg），根据样品的性质及仪器的灵敏度等因素，然后确定线性范围，线性范围中最高点的标液浓度一般是重金属元素的限度浓度的1~2倍，这是比较关键的一步。

     例子：称取2g蛋鸡浓缩饲料,经炭化、灰化，酸溶解处理后，定容到50mLA级容量瓶中，如果样品中铅的含量为铅的限量13mg/kg，那么样品中的浓度为0.52μg/mL，设定标液曲线范围的最高点浓度为1.0μg/mL，由于大部分样品的含量都在铅的限量13mg/kg一下，所以照称样量为2g，定容到50mL，线性范围为0~1.0μg/mL是比较合适的。标准曲线配制步骤（以铅标准曲线配制方法为例）：

     （1）用移液枪取1mL购买的铅1000μg/mL标准溶液定容到100mLA级容量瓶中，加入2mL6mol/L盐酸，用超纯水定容，摇匀，得到10μg/mL铅标准储备液；

     （2）用5mL刻度移液管分别取0mL、0.5mL、1mL、2mL、4mL、5mL10μg/mL铅标准储备液到6个50mLA级容量瓶中，在各个50mLA级容量瓶中加入1mL6mol/L盐酸,用超纯水定容，摇匀，得到0、0.1、0.2、0.4、0.8、10μg/mL铅标准工作液

     （3）将标准工作液导入原子吸收分光光度计，用超纯水调零，在283.3nm波长处测定吸光，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线（仪器可以自动进行绘制标准曲线）。

     1.1.1标准曲线配置注意事项

     （1）首先要确定标准曲线的范围，可以从重金属的限值入手，GB13078-2001《饲料卫生标准》中，部分饲料及原料的铅限值如表1。

     然后调整称样量，如果按照磷酸盐中铅最大限值30mg/kg，称取1g磷酸盐样品，处理后定容到50mL,那么样品溶液浓度为0.6μg/mL，由于大部分的饲料及饲料原料含重金属铅的量都要比限值低，详见表2。

     所以要灵活调整标准曲线的范围，或者称样量的大小。

     （2）要考虑仪器测量该金属元素的灵敏度，如果测量该元素的灵敏度低，可以适当地增加称样量，减少定容体积，增大标准曲线溶液的浓度。相反，如果该元素的灵敏度高，要相对减少称样量，增大定容体积，必要的时候进行稀释。

     （3）如果样品含量较高（需要经验），在称样时和定容时应该考虑最好使样品溶液的浓度落在标准曲线的1/3~2/3的浓度范围，在这个范围时，测量的准确性和精密度相对较高。

     （4）配制标准曲线时，尽可能使用校正过的移液枪、移液管、容量瓶，标准溶液中间储备液在配制好后放置一段时间（本实验室一般为10~20min）再稀释成标准曲线系列工作溶液。

     （5）在稀释标准溶液，配制标准系列时，使用同一个移液枪或者刻度移液管进行释，保证相同的偏差，有利于配制出相关系数较好的标准系列工作液。

     1.2检出限

     检出限是评价一个分析方法重要指标,是指某一特定分析方法,在给定的显著性水平内,可以定性地从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量。检出限用于考虑方法是否具备灵敏的检测能力。常根据检测对象、检测目的的不同对检测方法的检出限作出具体规定。

     因为重金属属于卫生指标中限制使用物质，分析方法的检出限应该足够灵敏。本文指定检出限等于3倍样品空白的标准偏差（S）除以标准曲线斜率（b）得到的值（检出限单位与标准曲线系列浓度单位相同）。

     方法检出限测定步骤（以铅检出限为例）：

     （1）在每次检测时，都要制作铅的样品空白（通常即试剂空白，既除了不加标准溶液以外，其他试剂与酸的量与处理样品的相同）。

     （2）将仪器各参数调至正常工作状态，用超纯水调零，测试铅标准系列：0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0μg/mL铅标准工作液，软件中设定对每个浓度点分别进行三次吸光度读数测定，按照仪器软件给定的工作曲线，得到工作曲线的斜率（b）。

     （3）用超纯水调零后，对铅的一个样品空白进行20次连续测定，记录下吸光度值，计算20次空白样品吸光度值的标准偏差（s）。

     （4）根据公式：CL=K×S/b式中：CL：方法的检出限；

     （1）由于不能或很难找到一个完全和样品基体完全一致，却不含待测元素的空白样品，所以一般使用试剂空白作为样品空白，试剂空白参与前处理全过程，可以对整个前处理中试剂、水、器皿等污染情况起到监控作用。

     （2）检出限的计算方法有多种，应该按照对应的方法和仪器进行选择，通常为了能够反映分析方法在整个分析处理过程的误差，可采用已知结果的标准物质或者样品按照分析步骤进行测量，通过分析12份已知结果的实际样品来计算方法的检出限，计算公式如下：

     （3）如果所测元素灵敏度低（吸光度小,有可能样品空白吸光度值接近0），可以参考（2）的检出限计算方法，选择一个浓度低（一般为检出限的3~10倍），稳定性和均匀性都较好的样品进行检出限测定。

     （4）检出限单位的统一，测出来的检出限的单位要与标准曲线系列的浓度单位相一致，比如标准溶液的浓度是μg/mL，检测限的单位也是μg/mL，如果要换算成mg/kg，可以乘以相对应的称样量和定容体积。假如原子吸收火焰法测铅检出限浓度=0.03μg/mL，称样量为1.0000g,定容体积为50mL，那么该方法铅的检出限=0.03×50/1=1.5mg/kg。

     

     1.3定量限 

     定量限是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。

     定量限可确定为标准曲线的最低点浓度，或等于10/3倍检出限，理想情况下其7次连续测定值的相对标准偏差为10%以下。

     （1）定量限如果是确定为标准曲线的最低点浓度，那么这个最低点的浓度一般为检出限的3~6倍为宜，且7次连续测定值的相对标准偏差在10%以下。

     （2）定量限确定后，也要选择与定量限浓度相近的样品进行测量，并量7个平行样的浓度，其相对标准偏差在10%以下。

     准确度：样品中待测物测定值（结果）与被测量真值或约定真值间的一致程度，以误差来表示。它用来表示系统误差的大小。

     在实际工作中，通常用重复分析标准物质（实物标样）或加标回收实验进行方法准确度评定。通常标准物质（实物标样）比较贵，而且与样品基体相近的标准物质一般很少，故本实验室常用加入被测定组分的纯物质进行回收试验来估计和确定准确度。

     用添加标准溶液的方法测定方法回收率，原则上添加的浓度以接近样品中待测物质的浓度为宜，一般为样品浓度的0.5~2.0倍，而且样品浓度和添加的浓度之和不超过标准曲线线性范围的十分之九。所以在选择加标样品时，要考虑到样品的浓度范围（一般为标准曲线线性范围的三分之一处为）。

     样品加标回收方法操作步骤（以铅为例）；

     （1）选择稳定性，均匀性较好，代表性强，浓度适合的样品，如测铅时，选择鸭饲料样品（已经测过的，含量为10mg/kg）。

     （2）称取2g鸭饲料（处理后定容到50mL容量瓶中，浓度为0.4μg/mL）共17个平行样品，其中15个分成三组，每组5个平行样，第一组加入0.5mL20μg/mL铅标准储备液,加标量为10μg，加标浓度相当于0.2μg/mL；第二组加入0.75mL20μg/mL铅标准储备液,加标量为15μg，加标浓度相当于0.3μg/mL；加入1mL20μg/mL铅标准储备液,加标量为20μg，加标浓度相当于0.4μg/mL。加标后的三组样品理论上总浓度分别为0.6、0.70.8μg/mL。

     （3）未加标和加标后的鸭饲料样品按照方法的前处理步骤进行处理（如果是用干灰化法，则进行炭化、灰化，酸溶解）。

     （4）处理好的鸭饲料样品，导入原子吸收测定，

     得到加标和未加标鸭饲料样品中铅的测定浓度；

     （5）根据加标回收率公式：

     本实验室对于回收率的要求，参照GB/T27404-2008《实验室质量控制规范-食品理化检测》中的附录F，如表3。

    

（广东海大集团股份有限公司，庞玉龙，聂灿军，黄家明）