阿莫西林又名羟氨苄青霉素，是一种广谱青霉素类抗生素，对包括胸膜肺炎放线杆菌在内的猪呼吸系统的主要病原菌有很强的活性［1］。阿莫西林给药后在肺组织可以达到较高的浓度，它对猪胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度为0.1μg/mL［1－3］。研究表明阿莫西林在猪气管和支气管中的浓度是血浆中3倍［4］，因此，如果阿莫西林在猪血浆中浓度在0.3mg/mL以上，就可以起到杀死猪胸膜肺炎放线杆菌的作用。在临床应用中通常采用阿莫西林钠和阿莫西林三水合物。目前，关于阿莫西林三水合物在猪肌注的药动学研究比较少。为此，本试验将对猪肌注阿莫西林三水合物的药动学特征进行探讨，为阿莫西林的临床用药提供合理依据。

     18头健康杜长大三元杂交(杜洛克×长白×大约克)商品猪，体重(15±5)kg，购于武汉市新洲区某猪场。打耳号编号，圈养，自由采食及饮水，非给药期间饲喂不含药物的全价日粮，试验前适应性饲养7d。

     1.2药品和试剂

     阿莫西林三水合物，购自武汉福鑫化工有限公司。阿莫西林标准品，购自中国兽医药品监察所。三氯乙酸、甲醛、乙醚、甲醇、乙腈为国产分析纯试剂。

     注射阿莫西林三水合物水溶液的受试动物分别在给药前和给药后0.17、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、4、6、8、10、12和24h采集前腔静脉血液3～5mL，血液肝素抗凝，3000r/min离心10min，取上层血浆，密封保存于－20℃待测。

     色谱柱:AgilentSB－Aq色谱柱，250mm×4.6mm，5μm;检测波长:激发波长:355nm，发射波长:435nm;流动相:磷酸二氢钠缓冲液(0.05mol/L，pH5.6)∶乙睛=80∶20;流速:1.0mL/min;柱温:35℃;进样体积:80μL。

     1.4.2血浆样品处理

     精密吸取0.5mL血浆，置于10mL的离心管中，加入1mL的超纯水，漩涡混匀，加入20%的三氯乙酸溶液1mL，旋涡混旋2min，10000r/min离心10min，吸取全部上清液置于15mL离心管中，加入7%的甲醛溶液0.5mL，旋涡混匀。在100℃沸水浴中加热45min，再立即用冰水冷却5min，加入0.5g氯化钠破乳，然后加入5mL乙醚，在振荡器上以230次/min的频率振荡20min，3500r/min离心10min，吸取上层有机相，在60℃水浴中用氮气吹干，残渣用0.5mL流动相溶解，经0.22μm的滤器过滤后，取80μL进行HPLC测定。

     1.4.3标准曲线的测定

     精密吸取0.45mL的空白血浆，置于10mL的离心管中，添加50μL稀释好的标准贮备液，使阿莫西林浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、5和20μg/mL，漩涡混合1min后静置30min。样品处理方法同1.4.2记录色谱图和峰面积，将所得峰面积与对应添加浓度进行拟合，绘制标准曲线，求出标准曲线回归方程和相关系数。

     精密吸取0.45mL的空白血浆，置于10mL的离心管中，添加50μL稀释好的标准贮备液，使阿莫西林浓度分别为0.1、2和20μg/mL，漩涡混合1min后静置30min。样品处理方法同1.4.2。每个浓度样品测定3次，重复5d，分别计算回收率、样品日内、日间相对标准偏差及日间变异系数。

     1.5数据处理

     根据阿莫西林的血浆标准曲线计算两药在各采样时间点血浆中药物浓度，用WinNonlin(Version5.2.1)软件对血药浓度－时间数据进行拟合，用非房室模型计算药动学数据。

     本试验所建立的阿莫西林检测方法，血浆中内源性物质对阿莫西林无干扰，杂质与药物峰分离良好。空白血浆、添加阿莫西林标准品(0.1μg/mL)的血浆样品及猪实测血浆样品色谱图见图1～3。

     由制备的几个不同浓度梯度的标准曲线测定结果表明，阿莫西林在0.10～20μg/mL浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=24.441x+0.1262，式中y为峰面积值，x为所测血药浓度，相关系数r=1。

     血浆中阿莫西林添加浓度为0.10、2和20μg/mL时，其平均回收率介于89.0%～97.7%之间，相对标准偏差(ＲSD)介于6.1%～12.7%之间。表明该方法具有较好的回收率和精密度，符合定量分析要求。

     18头猪肌注阿莫西林水溶液后各采样点的平均血药浓度见表1，血药浓度－时间曲线见图4。用药动学软件Winnorlin的非房室模型对数据进行拟合，药动学参数见表2。

     阿莫西林为低紫外吸收药物，其最大紫外吸收在210nm左右，在此吸收波长处，血浆中的大多数物质均有紫外吸收，因此，如果采用紫外检测器进行检测，血浆中阿莫西林与内源性物质的色谱峰分离就较为困难。Krauwinkel等［5］、Soenens等［6］和Nelis等［7］用固相萃取法，Carlgvist等［8］和Cass等［9］用柱切换法解决以上问题，但操作繁琐、仪器设备复杂，成本较高。在阿莫西林的药动学研究中，主要是将阿莫西林进行荧光衍生，用HPLC荧光检测器测定血浆中阿莫西林浓度。

     本研究为了节省时间，减少操作步骤，也曾根据文献报道，采用HPLC－UV检测器进行检测。尝试了直接沉淀蛋白［10－13］和液液萃取［14－15］但不进行荧光衍生的方法，按文献中的紫外色谱条件进行检测，阿莫西林的药物峰与血浆内源性物质的色谱峰难以分离，调节流动相比例和pH值，更换不同的色谱柱，都无法解决这一问题。

     本研究通过参考国内有关方法，最终确定以三氯乙酸沉淀蛋白，加入甲醛为衍生化试剂，100℃水浴条件下进行衍生［16－17］。流动相为乙腈∶磷酸盐缓冲液=20∶80，可以得到较理想的测定结果。

     3.2阿莫西林肌注给药的药动学特征

     文献报道肌注阿莫西林普通注射液，Cmax=5.1μg/mL，Tmax=2.0h［18］;而本研究肌注阿莫西林水溶液的结果Cmax=(5.62±0.74)μg/mL，Tmax=(1.53±0.40)h，与其相吻合。阿莫西林对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC值为0.1μg/mL［1］，对于猪而言，血浆中药物浓度为0.3μg/mL时可以达到治疗效果。本研究中，猪肌肉注射阿莫西林水溶液后，在8h时浓度仍可达0.56μg/mL，因此，在使用阿莫西林治疗猪胸膜肺炎放线杆菌感染时，可以每天给药2次。

(长江大学动物科学学院，陶恒勋，袁晶)