20世纪50年代之前，人们一直被动物的疾病预防与控制等问题所困扰，50年代时，人们发现如果动物食用添加抗生素的日粮，可明显提高其产量，此项发现对畜牧业的发展做出了重要贡献。然而，随着时间的推移，添加抗生素这一举措带来的危害日益显现且逐渐加重，受到社会各界的重视。因此，人们逐渐关注能减少抗生素使用的疾病预防与控制手段。

     乳酸菌是自然界中广泛存在的一类非常重要的微生物，在生长过程中会产生许多具有抑菌作用的物质，包括酸、过氧化氢、细菌素和类细菌素等，对维持胃肠道的生理功能具有重要作用。饲用乳酸菌在改善肠道菌群结构、增强动物免疫能力和提高动物生产性能等方面具有积极作用，而且具有无抗药性、无毒、无药物残留及无污染等特点，正成为饲用添加剂的研究热点。

     乳酸菌主要是通过活菌积极的生命活动达到调节菌群平衡的目的，因此活菌含量是一个重要的指标。动物胃肠道的胃酸、胆盐及其他多种酶类对益生菌均有潜在的灭活作用，耐受这些环境同时保证足够的活菌数是益生菌定植于动物胃肠道并发挥益生作用的前提。因此在饲用乳酸菌菌种筛选过程中，应着重考察其在胃肠道环境中的存活能力。研究运用生物化学方法和分子生物学手段对乳酸菌进行筛选和鉴定，并对其抑菌活性、生长特性和人工胃肠液耐受能力进行研究，旨在选育能够产生抑菌活性物质，且耐受猪体胃肠液的优良乳酸菌，为饲用乳酸菌添加剂的制作提供优良菌种，为抗生素低减型生猪生产寻找新的途径。

     试验菌:植物乳杆菌、乳酸乳球菌和戊糖片球菌等共264株(实验室保存)。指示菌株:沙门菌50094、大肠杆菌30105和李斯特氏菌26003购于河南省食品药品检验所。培养基及主要试剂:MＲS培养基，NA培养基，LB培养基;过氧化氢酶，胃蛋白酶(酶活力≥1200U/g)，胰蛋白酶(酶活力≥5万U/g)，菌株DNA提取试剂盒。

     将保存于－80℃冰箱中的264株乳酸菌活化后，接种到MＲS液体培养基，30℃培养24h，制备乳酸菌发酵上清液(12000r/min，4℃离心10min);分别挑取各种指示菌的单菌落在NA培养基上划线，30℃恒温培养24h制备指示菌菌悬液，采用牛津杯双层平板法进行抑菌试验。

     1.2.2酸作用的排除

     挑取对3种指示菌均有抑制作用的菌株接种到MＲS液体培养基，30℃培养24h，测定其发酵上清液的pH，并用2mol/LNaOH将其pH调至7.0，同时将乳酸的pH调至7.0作为对照，用牛津杯双层平板法进行抑菌试验。

     1.2.3过氧化氢酶作用的排除

     将乳酸菌MＲS液体培养发酵上清液pH调至7.0，加入终质量浓度为1.0mg/mL的过氧化氢酶，37℃水浴2h，以未经过氧化氢酶处理的pH7.0的发酵上清液作为对照，检测其抑菌活性。

     1.2.4人工模拟胃液耐受性检测

     参照Galindo的方法，将试验菌株接种于100mLMＲS液体培养基中30℃培养36h，4℃，4000r/min离心15min，收集菌体，用0.1mol/LPBS(pH6.0)洗涤3次，重悬质量浓度为10～100亿CFU/mL备用。取2mL菌悬液加入98mL0.1mol/LPBS(pH6.0)，按1%比例添加胃蛋白酶，混匀，迅速用2mol/LHCl将混匀液pH分别调节至2.0、2.5、3.0、3.5和4.0。37℃恒温震荡(175r/min)培养，分别于培养0和1h取样稀释涂布MＲS固体培养基，30℃培养48h后进行平板菌落计数。

     1.2.5人工模拟肠液耐受性检测

     菌悬液制备方法同1.2.4。分别取2mL菌悬液加入98mL0.1mol/LPBS(pH6.0)，按1%比例添加胰蛋白酶，加入牛胆盐，使胆盐质量分数为0.3%，混匀，迅速用2mol/LNaOH将混匀液pH分别调节至6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。混匀后37℃恒温震荡(175r/min)培养，分别于培养0和3h取样稀释涂布MＲS固体培养基，30℃培养48h后进行平板菌落计数。

     相对于G－指示菌，实验室保存的264株乳酸菌发酵上清液对G+指示菌的抑菌率较高。从图1可见:对李斯特氏菌的抑菌率达45.50%，对大肠杆菌和沙门菌的抑菌率分别为31.75%和35.07%。其中对3种指示菌均有抑制作用的菌株共66株，抑菌率达31.28%。图1

   

     乳酸菌发酵上清液对指示菌的抑菌率在排除酸干扰后，具有广谱抑菌作用的66株乳酸菌中仍有14株菌对G+和G－指示菌有一定程度的抑制作用，而pH7.0乳酸(对照组)对指示菌没有抑制作用，结果见表1。从表1可见:这14株菌在排除酸作用后发酵上清液中仍然存在着抑菌活性物质，其中A190、A491、A513和A104对3种指示菌的抑制作用较强。

   

     筛选酸作用排除后有较强抑菌活性的乳酸菌A190、A491、A513和A104进行过氧化氢酶作用的排除试验。结果表明，过氧化氢酶处理前后，各菌株抑菌圈直径变化不显著，证实其发酵上清液中对G+和G－指示菌有抑菌活性的物质不是过氧化氢。

     2.2乳酸菌的理化特性

     对具有较强抑菌活性的4株乳酸菌进行各项生理生化指标的鉴定，鉴定结果见表2

   

     从表2可见:A190和A491在pH3.0的环境中生长增殖旺盛，而A513和A104在pH3.0的条件下生长微弱。此4株乳酸菌均具有较强的耐盐能力，能够在6.5%盐质量分数条件下生长，因此，能够在猪体内高渗的环境中生长繁殖。

     根据形态学和生理生化特性和16SrＲNA基因序列等特征对筛选的4株乳酸菌进行鉴定，鉴定结果表明，菌株A190和A491属于植物乳杆菌，菌株A513属于戊糖片球菌，菌株A104属于乳酸乳球菌。

     2.3乳酸菌的人工胃液耐受性

     4株乳酸菌与不同pH的人工胃液作用1h后，检测到的活菌数变化和存活率见表3。从表3可见:在与人工胃液作用1h后随着人工胃液pH的下降，4种乳酸菌活菌存活率逐渐降低。pH2.0时A190存活率为0.3%，其他3株菌的存活率为0;pH2.5时A190和A491的存活率高于A104和A513;在pH3.0、3.5和4.0条件下，A190的存活率均大于70%，而其他3株菌的存活率均小于70%。因此，A190对人工胃液的耐受性较强。

   

     2.4乳酸菌的人工肠液耐受性

     4株乳酸菌与不同pH的人工肠液作用3h后，检测到的活菌数变化和存活率见表4。

   

     从表4可见:随着人工肠液pH的升高，4株菌的存活率呈上升趋势。猪的小肠液是一种弱碱性物质，pH约为7.6，人工肠液pH7.5时，A190的存活率大于70%，而其他3株菌的存活率均小于70%，因此A190对人工肠液具有更好的耐受能力。

     因食物种类不同，动物胃液pH的波动较大，如猪胃中的pH常在2.0～7.0，但一般在3.0左右，因此，以pH3.0作为耐酸性菌株筛选的标准。猪体胃肠道中NaCl质量浓度在1.00～4.00g/100mL波动。不同的微生物对渗透压的抵抗力不同，环境渗透压超过一定限度将使微生物生长受到抑制。研究结果表明，A190和A491在pH3.0或6.5%盐质量分数条件下生长良好，具备应用开发潜力。

     3.2乳酸菌对胃液耐受性

     乳酸菌必须进入猪的胃肠道并达到一定浓度才能发挥其功能。从口腔到肠道过程中，乳酸菌首先必须以活菌状态通过胃才有可能进入肠道。A190在pH3.0的人工胃液中处理1h后存活率大于70%，表明其对人工胃液环境有较强的耐受能力，因此，A190以活菌状态进入肠道的可能性较大。

     3.3乳酸菌对肠液耐受性

     猪体消化道肠液中含有胰蛋白酶和胆汁盐，对菌株的存活有很大的影响。小肠液是一种弱碱性液体，pH约为7.6。活菌进入肠道后，要对环境具有一定的持续耐受能力，才能保证其正常发挥作用。A190在pH7.5的人工肠液中处理3h后存活率达到77.37%，说明其能够耐受人工肠液环境，因此，A190能够在肠道中存活并发挥益生作用。

     乳酸菌A190属于兼性厌氧型乳酸菌，分离自苜蓿样品，纯天然，无毒害;作为添加剂使用成本低廉，操作简便;而且A190具有较强的耐酸性、耐盐性、抑菌活性及对胃肠液的耐受性，满足饲用乳酸菌筛选的前提条件，可作为饲用乳酸菌的潜在开发菌株。将进一步探索菌株A190作为饲用添加剂的添加形式、制备工艺及在猪生产应用中的实际效果。

(郑州大学离子束生物工程省重点实验室，袁世超，王雁萍，李东霞，杨慧晓）