样本总体为我国年出栏量大于1000头的规模猪场，总数为88195个。采用PPS多阶段分层抽样，预计养猪场发生腹泻的流行率为70%，可接受误差为5%，置信区间为95%，计算需要采集的样本数为323。

　　分层时采用2层抽样，第一层采取随机抽样方法，从32省份中随机抽取5省份，分别为广西、河南、湖南、江西和四川；第二层按照养殖规模按比例随机抽样[6]，根据2012年畜牧业年鉴统计数据中5省、区的养殖规模和养猪场数量，利用PSS抽样原则，每个省分配相应数量的养猪场，首先将年出栏生猪数量作为抽样的权重，计算不同规模猪场的抽样数量：某种规模猪场的抽样数=某种规模猪场出栏数/总的出栏数×全国抽样数量，然后将各省生猪出栏数量作为抽样权重，计算各省不同规模猪场的抽样数量，抽样结果详见表2，在分层抽样时考虑到分层效应（DEF=1.2），需调查养猪场387个。详见表1和图1。

     

    

　　实际调查时，因猪场的配合度及问卷质量等问题，除一个省应调查的87个猪场变为76个，其它省份均超过了原定的抽样数量；3000-4999类规模场由原定为93个，实际为77个，其余3种规模场均超过了原定的抽样计划（表1）。

　　研究设计了结构性调查问卷，内容包括养猪场的地址、联系人、养殖年限、养殖量、腹泻发生情况、袭击率、致死率、消毒情况、免疫情况、孵化房的温度和保温设备、专业兽医、饲料配制等23个问题。调查的每一个猪场均填写一份调查登记表，由专门的流行病学调查人员到养猪场进行现场调查，共发放了450份调查表，回收407份，回收率为90.44%。

　　每猪场采集10份不同窝的仔猪的粪便样品，样品用10ml样品管收集，每份样品采集约5克左右，置-20℃冻存。

　　将采集的粪便样品按照1：5的比例加入PBS缓冲液15ml，在研钵中进行研磨，然后5000rpm4℃离心10min，吸出上清液经0.22μm过滤除菌。

　　取250μL上清液提取RNA。RNA的提取按试剂盒TRIzol（Invitrogen公司）说明书进行，提好的RNA用20μLDEPC处理水溶解，-20℃冻存备用。根据参考文献发表的序列[7]，设计1对引物，进行RT-PCR扩增，首先制备cDNA，然后用一步法试剂盒进行PCR扩增。

　　PCR结束后，取10μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中进行观察，阳性条带者送宝生物公司进行测序和分析。

　　用Excel软件进行数据录入、整理和初步分析，用ArcGIS软件对调查猪场空间数据进行分析，用SPSS和EpiInfo软件进行多因素Logistic回归分析。

最近3个月之内，407个猪场有293个猪场（71.99%）发生过腹泻，114个猪场（28.01%）未发生过腹泻。发生腹泻的猪场中，随着养殖规模的增加，腹泻发生的比例逐渐下降，年出栏1000-2999的养猪场腹泻的流行率为80.79%（95%CI，73.44%~87.21%），而年出栏超过10000的养猪场腹泻的流行率为59.30%（95%CI，48.17%~69.78%），腹泻与养殖规模之间呈现负相关（R2=0.8744），详见表2和图2。

      

　　出现腹泻的猪场中，不同种群猪的腹泻流行率和病死率不同，其中母猪、育肥猪、保育猪和哺乳仔猪发生腹泻的流行率分别为3.48%（95%CI，2.24%~4.96%）、2.4%（95%CI，1.35%~3.63%）、12.78%（95%CI，10.25%~15.41%）和33.80%（95%CI，31.02%~36.86%），病死率分别为0.7%（95%CI，0.24%~1.41%）、0.43%（95%CI，0.17%~0.78%）、12.55%（95%CI，10.31%~14.73%）和34.16%（95%CI，30.67%~37.70%），详见表3。

　　分别计算此次调查所涉及养猪场的饲养规模、养殖类型、猪场消毒情况、免疫情况、母猪产房温度、消毒和保温设施等相关因素的OR值，经分析发现猪场的养殖年限、车辆进入猪场是否消毒、母猪有单独的产房、母猪产房是否具有保温设施和保暖性、猪场是否有地下的粪便沟渠等因素的OR值差异较大，而且P值均小于0.2，另外还发现母猪存栏量、年出栏量等也与腹泻发生有关，同样P值均小于0.2。详见表4。

　　用Epiinfo软件中的多项logistic回归方程分析风险因素，经过递减法除去非特异性因素和混杂因素，发现腹泻（Y）与养猪场的饲养年限（X1）、进入猪场前的消毒（X2）以及母猪产房维持足够温度（X3）有关，详见表5。

     

　　因此，基于上述结果可以建立腹泻相关因素的风险模型，用公式表示：

　　Y=2.41+0.71X1+0.93X2+0.93X3

　　将每个猪场采集的样品混在一起用RT-PCR进行PEDV的检测，结果表明，293个阳性场中有262个猪场为PEDV试验阳性（阳性率89.42%），提示PEDV可能是腹泻的主要病原。

　　猪腹泻是猪的一种常见多发性疾病，曾给我国养猪业造成过巨大损失，摸清导致腹泻病因和发病风险因素对防治腹泻十分重要。在实际流行病学调查工作中，面对我国基数庞大的养殖数量，选择合适的抽样框十分困难，根据畜牧业统计年鉴（2012）[8]，我国生猪饲养户数5500万个，年出栏生猪6.9亿头，其中500头以上规模场25.6万个，年出栏生猪2.8亿头，其中，1000头以上规模场8.8万个，年出栏生猪1.9亿头，占70%。2014年，我国500头以上规模猪场年出栏量已经占到总出栏量的38.5%，其中1000头以上规模猪场的年出栏量占69.7%，随着我国经济的发展，庭院养殖模式的养猪场/户的数量急剧萎缩，而规模猪场的比重逐年提升，并将成为我国养猪业的主要养殖模式。此外，规模场与疫病防控部门联系密切，开展的调查和采样也易完成，为此，本调查选择出栏1000头以上的规模猪场作为此次调查的对象。

　　调查和监测结果显示，我国规模猪场猪群腹泻的场流行率为71.99%（59.30%~80.79%），而且腹泻的流行率与养猪场的规模呈现负相关（R2=0.87），这一结果说明小规模猪场腹泻危害严重，提示小规模猪场是今后重点加强腹泻防控的对象。

　　在对我国猪群腹泻的风险因素进行分析时发现，养殖量、车辆进入猪场的消毒和产房保持足够的温度是影响腹泻的主要因素。在前期的调查中，曾经发现母猪产房温度低的仔猪发生腹泻的比例较高，据此推测母猪产房的温度可能会影响仔猪发生腹泻，为进一步寻找可能的风险因素，在调查中加入了是否有母猪产房、产房是否定期消毒、是否有保温设施、母猪产房地面是否干燥等问题，但结果显示只有产房温度这一因素影响腹泻的发生。

　　在调查中还发现接种疫苗并没有明显降低腹泻的发生，与未接种疫苗相比，接种猪流行性腹泻—猪传染性胃肠炎二联灭活苗发生腹泻的风险为1.09倍，接种猪流行性腹泻—猪传染性胃肠炎二联弱毒苗发生腹泻的风险为1.63倍，卡方检验结果显示差异不显著，表明现有的疫苗接种并未取得理想的效果。国内外多家机构研究发现，近年来危害严重的猪流行性腹泻的病原PEDV流行毒株与传统的疫苗株相比，S基因和M基因均已经发生较大变异，流行毒株和野毒株之间存在3个区域的碱基插入或缺失，S基因核苷酸的同源性为92.6%~98.2%，这些碱基差异或许是导致疫苗免疫效果不佳的原因。

　　鉴于猪腹泻是由多种病原引起的极其复杂的症侯群，尽管本次调查发现了影响腹泻的几种风险因素，也利用PCR技术从采集的猪场粪便样品中检测到了PEDV，但我们仍然不清楚PEDV是否单独感染引起腹泻还是与其他病原共同感染引起腹泻，还需要进一步开展流行病学研究，以便弄清这些因素在腹泻中的作用网络。

（中国动物卫生与流行病学中心，张　志，王幼明，李晓成）