猪感染牛病毒性腹泻病毒的诊断
牛病毒性腹泻病毒(bovineviraldiarrheavirus，BVDV)、猪瘟病毒(classicalswinefevervirus，CS-FV)以及羊边界病病毒(borderdiseasevirus，BDV)同属于黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus)，三者存在血清学上的交叉反应，由它们所引起的传染病每年给全球养殖业造成了巨大的经济损失。BVDV宿主范围较广，除感染牛外，还可以感染猪、绵羊、山羊、鹿及野生动物。猪感染BVDV后会出现类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化。Fernelius等于1973年首次从自然感染发病的猪体内分离出BVDV，证实BVDV能够引起猪自然感染。国内，王新平等于1996年首次从疑似猪瘟病毒感染病料中分离鉴定出BVDV;宋永峰等采用ＲT－PCＲ方法检测浙江等6个省市的43份猪病料，结果阳性检出率为16.3%(7/43);戴益民等对已做过CSFV检测的52份病料进行BVDV回归性检测，结果表明BVDV阳性率分别为10.0%(2004年)、14.3%(2005年)、12.5%(2006年)、15.8%(2007年);吴文辉等对2009—2010年疑似猪瘟病毒感染的287份样品进行BVDV抗原检测，结果阳性检出率达80.48%(231/287)。表明我国猪群中存在BVDV感染，分布范围较广，感染率较高，尤其近几年来，不断有BVDV感染并被分离的报道。鉴于CSFV与BVDV之间存在交叉感染的情况，本文对临床诊断中表现为猪瘟症状的病死猪进行了临床和实验室诊断，最终通过分子生物学方法和核酸序列鉴定确诊该猪场发生了BVDV感染，现将诊断过程介绍如下。
1发病情况
2013年春季，青海某种猪场所产仔猪陆续产有死胎、木乃伊胎，出生仔猪体弱，生长迟缓，腹泻、消瘦，死亡率不到10%。曾用青霉素、链霉素、磺胺类药物治疗，无显著效果。因怀疑是猪瘟病毒感染，曾用猪瘟活疫苗(细胞源)进行紧急接种免疫，未能完全控制疫情。
2临床症状
母猪产仔数量明显减少，且含有死胎、木乃伊胎，仔猪主要表现厌食，精神萎靡，发热，被毛粗乱，腹部皮肤、耳、尾、四肢具有针尖大小的红色出血点(斑)，腹泻，消瘦，死亡率不到10%，60日龄后逐渐康复，但康复后仍生长缓慢。
3病理变化
剖检病死猪，可见全身淋巴结都有不同程度的肿大，切面呈大理石样，周边出血，部分猪整个淋巴结呈血肿，心外膜、肾脏及膀胱黏膜有针尖状出血点，脾脏边缘有梗死灶、呈锯齿状，胃、结肠、盲肠黏膜溃疡，部分可见有多量的纽扣状溃疡灶。
4细菌分离
取无菌采集的病死猪肝、脾、肾组织病料样品涂片，革兰氏和瑞氏染色镜检，未发现有任何细菌。取无菌采集的病死猪肝、脾、肾组织病料样品分别接种于麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、厌氧肉肝汤中按常规方法进行细菌的分离培养与鉴定，结果均无任何细菌生长。
5分子生物学检测
5.1引物的设计与合成
分别根据参考文献分别设计针对CSFV强毒与弱毒、BVDV特异性检测引物，引物序列如表1所示，引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。
5.2样品的处理与病毒基因组的提取
将采集的肝、脾、肾组织病料样品混合加入9倍体积的灭菌生理盐水充分匀浆，反复冻融3次，10000r/min离心15min，取上清液，按病毒基因组ＲNA提取试剂盒(购自天津博美科生物技术有限公司)使用说明的操作方法提取组织病料的病毒基因组ＲNA。
5.3ＲT－PCＲ扩增与检测
以提取的病毒基因组ＲNA为模板，参照一步法ＲT－PCＲ试剂盒(购自TaKaＲa公司)使用说明，进行CSFV强毒、CSFV弱毒、BVDV的ＲT－PCＲ扩增。ＲT－PCＲ反应体系为:2×1StepBuffer25μL、StepEnzymeMix2μL、上下游引物P1、P2(或P3、P4或P5、P6)各0.5μL、5μLＲNA、加水至50μL。ＲT－PCＲ扩增程序为:50℃1h;94℃4min;94℃45s，57℃45s，72℃45s，30个循环;72℃10min。ＲT－PCＲ扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示，3份临床组织病料样品BVDVＲT－PCＲ扩增产物在位于154bp大小处均可见特异性DNA条带，其大小与祖立闯等的报道相符;3份临床组织病料样品CSFV强毒ＲT－PCＲ扩增均为阴性;3份临床组织病料样品CSFV弱毒ＲT－PCＲ扩增产物中有1份在位于447bp大小处可见特异性DNA条带，其大小与李艳等的报道相符，其余2份为阴性。
5.4核酸序列鉴定
将3份临床组织病料的BVDV和CSFV弱毒ＲT－PCＲ阳性扩增产物送北京三博远志生物技术有限责任公司进行序列测定，将测序结果应用Blast在线软件与GenBank中登录的序列进行比较分析表明，3份BVDV阳性ＲT－PCＲ扩增产物彼此间序列完全一致，其与GenBank中登录的BVDV毒株序列(AJ585412)同源性达99.4%;1份CSFV弱毒ＲT－PCＲ扩增产物核苷酸序列与GenBank中登录的CSFV弱毒株序列(AY805221)同源性达99.6%。
6诊断结论
经猪场发病情况、临床症状、病理剖检变化观察等临床诊断，以及细菌分离培养、病毒分子生物学检测、核酸序列鉴定等实验室诊断方法确定，该猪场此次发病由牛病毒性腹泻病毒感染所致。
7讨论
关于猪感染BVDV的来源，主要有免疫BVDV污染的猪瘟活疫苗和接触BVDV感染牛两种主要途径。范学政等用ＲT－PCＲ方法对23批次的猪瘟疫苗进行BVDV检测，结果显示，5批次猪瘟疫苗被BVDV污染，污染率达21.74%;吴文辉等对猪瘟疫苗进行BVDV的检测结果表明BVDV污染阳性率高达34.8%。由此得出，猪接种BVDV污染的猪瘟活疫苗是猪感染BVDV的重要来源之一。牛也是引起猪感染BVDV的一个传染来源，比如接触了BVDV感染牛羊、采食了BVDV污染的饲料、接触了BVDV污染过的饲养工具等都可引起感染。有报道在英国某牛场新购进牛群与其相邻猪场的哺乳仔猪同时发生了病毒血症，并造成了仔猪死亡，经鉴定均为BVDV感染。对于本病例，采用ＲT－PCＲ方法检测猪场曾经免疫的猪瘟活疫苗为BVDV阴性，故排除了猪瘟疫苗带毒的可能，推测有可能是接触到了BVDV污染物。
本病例中3份临床组织样品经CSFV弱毒ＲT－PCＲ检测2份为阴性，1份为阳性，究其原因，可能是猪感染BVDV产生的抗BVDV抗体对猪瘟病毒有一定的抑制作用，使猪瘟疫苗在体内基本不复制或很少复制，导致猪体内CSFV病毒含量较少或没有。该结果与张慧英等和吴文辉等的报道表现出了高度的一致性，张慧英等研究结果表明BVDV在一定程度上干扰猪瘟疫苗的免疫效果，影响CSFV抗体水平;吴文辉等研究结果也表明猪场内生猪的猪瘟疫苗免疫效果在一定程度上受到BVDV的干扰。
从本病例的诊断中可以得出BVDV可以在猪场发病，并干扰猪瘟疫苗的免疫效果。在我国目前BVDV流行区域广泛的形势下，将给猪瘟的预防控制及净化带来了新的困难与挑战。因此，对猪感染BVDV的现状必须有清醒的认识和必要的防控措施，建议加强对猪群中BVDV的监测，及时淘汰阳性感染猪，保障畜牧养殖业的健康发展。
(青海省海西州都兰县香日德镇畜牧兽医工作站，吕建军)
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