由于性腺的发育与性激素的释放，孵化中后期雌胚尿囊液中雌激素的含量远高于雄胚，通过测定胚蛋尿囊液或羊水中雌激素含量，可对胚胎性别进行鉴定。美国Embrex公司已为此项技术及与之相配套的胚蛋尿囊液取样定位技术申请了两项专利(专利号为6506570和6510811)，前者是对雌激素进行检查的方法，后者则提供了对胚蛋尿囊液进行采集或定位的方法。这两项专利为生产自动化禽类雌雄鉴定设备提供了技术基础，但目前尚无相关产品问世。该方法的缺点在于需要孵化至中后期(16d左右)才能进行鉴别，同时尿囊液的采样会破坏鸡胚蛋的蛋壳，对孵化率会造成一定影响。

     该方法主要依赖于Z染色体与W染色体在形态上的区别，通过对分裂旺盛的组织进行取样，并制片观察其有丝分裂中期染色体的形态来鉴定样本的性别。但某些禽类如鸵鸟的Z染色体与W染色体的长度、大小差异均不明显，且取样操作对胚胎损伤较大，操作时间长，很难获得高质量的染色体中期分裂相，因此难以在生产实践中推广应用。

     由于性染色体Z和W上的DNA含量不同，不同性别个体的细胞中DNA含量相差0．6%～3．5%，可用碘化丙啶对细胞核染色，然后通过流式细胞仪分析细胞基因组大小，并据此判断样本性别。该方法缺点在于仪器本身价格昂贵，鉴别成本较高。

     家禽的性别由W染色体与Z染色体决定，因此用于性别鉴定的目的基因都位于性染色体上，主要有CHD1基因、EE0．6序列及XhoⅠ重复序列等，其中后两者为假基因序列。

     CHD1基因在非平胸总目家禽基因组中有2个同源拷贝，即CHD1－W与CHD1－Z，前者与W染色体连锁，后者与Z染色体连锁，二者的内含子大小差异很大，可通过设计特异性引物进行PCＲ扩增，产物直接电泳，或经限制性内切酶特异性酶切后电泳，根据产生的条带数目对样本性别进行区分。直接电泳时，雌性为2条带，雄性为1条带;酶切后电泳时，雌性为3条带，雄性为1条带。该方法可用于鸡、鸭、鸽子、鹌鹑及部分鹤形目鸟类的性别鉴定，只需采集少量胚胎尿囊液样本、血液样本或成禽羽毛样本即可，不同鸟类扩增的适用引物对各不相同。目前，该基因的PCＲ鉴别方法已在鸭与鸽子上申请了相关试剂盒专利。

     EE0．6序列仅存在于W染色体上，根据该序列扩增条带的有无同样可以鉴定性别;亦有研究者通过双引物扩增PCＲ法进行扩增，电泳结果出现2条带的为雌性，1条带的为雄性。双引物扩增PCＲ法可有效防止PCＲ扩增失败造成的假阴性结果，提高判别准确率。这一序列可用于火烈鸟、黑冠鹤、东方白鹳等鸟类的性别鉴定。

     XhoⅠ重复序列为家鸡W染色体上一个基因家族，有研究表明其中长度为0．6kb的一段重复序列与性别有关，设计引物对其进行特异性扩增可鉴定样本性别。由于该片段仅存在于W染色体上，在实际鉴定中应采用双引物扩增PCＲ法以排除假阴性结果，提高判别准确率。

     PCＲ法具有采样量少、取材方便、操作简便等优越性。但由于该方法是采样操作，尤其是采血操作会对胚胎造成影响，可能影响其孵化率与健雏率，目前该方法多用于实验室操作及珍稀鸟类出壳后的性别鉴定。

     鸡胚发育至7天左右时，解剖胚胎可明显看出雌雄胚胎性腺差异，据此亦可准确判断性别。雄胚性腺为2条白色、接近对称的短棒样组织，雌胚则呈现一侧退化、另一侧片状的发育形态。但该方法会使胚胎死亡，无法继续孵化，多在实验室应用，目的是验证胚胎性别。

     已有研究表明，鸡原始生殖细胞与性腺的发生、发育存在一定关系。孵化前3天，在未来性腺位置处出现上皮增厚时，外迁的原始生殖细胞(PGCs)渗入脏壁层的体腔上皮，出现性腺的形态。PGCs的迁移与卵黄血管的形成存在一定关系，有研究表明血管的发育会影响睾丸形态结构的形成。这些研究结果均表明，卵黄囊血管形态与性腺发育之间存在一定联系，可用于判定性别。

     早在1976年，马任骝对3．0～3．5日龄的鸡胚和4．0～4．5日龄鸭胚进行壳外透视、破壳观察和性腺解剖，结果发现，在种蛋质量、孵化条件等相同情况下，胚外卵黄囊血管分布与性别存在一定关系，雄胚主血管明显、血管较粗、分布均匀，雌胚血管纤细、分支较多、不规则，准确率达70%～90%。此后，一直没有相关的研究报道，原因可能是该方法的判定标准不好统一，或者在那个特殊的历史年代，数据的准确性值得怀疑。直到2000年，李振钢等根据鸡胚蛋血管分布形态制作了雄性鸡胚蛋的标准模板，并据此对3日龄鸡胚进行性别判定，准确率为84%。接下来几年，李振钢和其他学者给出了血线方向与鸡胚性别的函数关系式，同时增加了血线图像与背景之间的对比度、将血线骨架化及编制了判别程序。此后，没有后续报道，也没有推广到生产实践中去，可能与复杂的处理方法有关。

     与其他性别鉴定技术比较，在早期(孵化3～5d)应用血管形态鉴定法进行雌雄鉴别，可及早对鸡胚进行合理安排，节约孵化成本;同时，该技术操作简便，不破坏蛋壳，对后期孵化影响较小，几乎不影响孵化率和出雏率。另外，随着该技术的完善，可实现机械光源透照与计算机自动识别雌雄，达到商业化的目标。但是，这项技术至今未像翻肛鉴别法一样推广到生产中去，其鉴别的技术标准和稳定性还有待提高。

     有研究人员利用蛋形指数对禽胚蛋进行早期性别鉴定并作了报道，但目前仅限于对黔东南小香鸡与鹌鹑的研究，并认为蛋形指数与性别比例无直接关系，且试验重演性较低，故可认为蛋形指数与禽胚蛋性别无关。

     目前，禽胚蛋的性别鉴定已研究出多种方法，如基于胚胎发育过程中性激素含量差异的尿囊液雌激素含量检测法，基于性染色体基因序列差异的PCＲ鉴定法，基于胚胎发育过程中血管形态差异的卵黄囊血管形态鉴别法等。这些方法与翻肛鉴别法比较均有一定的时间优势，但也均存在一定缺陷。如尿囊液雌激素含量检测法会破坏蛋壳，对孵化率与健雏率造成影响;分子生物学方法检测或操作复杂，或器材价格昂贵，均不适于大规模生产鉴定;卵黄囊血管形态鉴别法虽不破坏蛋壳，但目前判别标准模糊，准确率不稳定。因此，想要对禽胚蛋进行准确的性别鉴定，仍有待进一步研究与摸索。

(四川农业大学，叶子巧婧，杨雅茹，张宁宁，龙博文，杜晓惠)