猪流感的大规模流行，不仅对各国养猪业造成了严重影响，也对人类健康和全球经济安全造成了巨大威胁，这主要是因为猪是人流感病毒和猪流感病毒的“混合器”，大大增加了致病源的复杂性。2009年暴发的甲型H1N1流感病毒，包含了人流感病毒、猪流感病毒和猪流感病毒。如何在复杂的致病原中快速准确的诊断和监测猪流感，具有重要的经济学意义和公共卫生学意义。因此，猪流感检测诊断技术成为了世界各国的研究重点和申请专利的热点，掌握猪流感检测诊断技术在全球和中国范围内的专利申请情况，对其发展趋势和研究重点进行研究和分析，合理利用现有专利技术，对有效控制猪流感疫情具有重要的现实意义和深远的战略意义。

     本文以中国专利文献检索系统（CPRS）和德温特世界专利索引数据库（WPI）为文献来源。在相关领域主要分类号（A23L、A23K、A01K、A61K）中，以猪流感，防控，治疗，预防，检测等关键词进行中英文检索，检索截止日为2014年4月1日。在WPI数据库中检索到涉及猪流感的全球专利申请共计923项。

     以下从专利申请整体趋势、申请国家或地区分布、申请人类别、技术主题等角度对猪流感领域的世界和国内专利状况进行分析。

     从申请数量上就可以看出，猪流感防控专利大大落后于禽流感病毒（截止到2014年4月1日，8408件）、冠状病毒（截止到2014年4月1日，4709件）等可以导致人畜共患病的热门病毒。详见图1。

     由图1可以看出，在2001年以前，在全球范围内猪流感检测技术专利申请数量较少。2004年，全球申请量和中国申请量都出现大幅度的提升，尤其是在2006年之后，世界申请量和中国申请量都呈爆发式增长，这与世界范围内对猪流感的重视程度的提升和流感病毒在全球范围内的流行有密切联系。

     反观我国猪流感检测技术专利申请量的发展态势，也呈现出逐年上升的趋势，这种趋势不仅与国家出台相关政策和方案息息相关，也与我国规模化养殖和生产的不断铺开相关。2009年世界卫生组织成立猪流感应对委员会，2009年4月30日卫生部办公厅印发了《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》，同年卫生部印发了《人感染猪流感诊疗方案》。相信随着我国猪流感防控体系的逐渐完善、社会各界对猪流感防御意识的逐渐提高，未来几年我国在该领域的专利申请量将继续保持增长态势。

     国外禽流感专利申请量的地区分布情况详见图2。

     从图2中可以看出，猪流感专利申请量在全球各个国家和地区间的分布不均衡，其中中国专利申请量最多，占全球相关专利申请总量的73%，具有绝对优势，这种现状与生猪养殖是我国战略性政策的现状有直接关系，同时，也说明我国对猪流感防控技术的研究和专利保护也比较重视。国家政策的影响力同时也体现在韩国和日本的相关专利申请数量上，二者分占全球申请量的9%和7%。由此可见，政府导向对专利申请的影响巨大，这也为我国政策制定给出了技术启示。

     国内禽流感专利申请量的地区分布情况详见图3。

     从图3可以看出，我国各省份的猪流感领域专利申请量分布，前3位分别是山东、辽宁和浙江，这与山东和辽宁是国内养殖大省的现状紧密联系，在上述2省中，农牧业，尤其是生猪养殖是其支出型产业。产业和科技的联系也从中有所体现。

     猪流感防控相关中国专利申请量排在前10位的申请人是：北京大北农科技集团股份有限公司（17件）、常州京森生物医药研究所有限公司（16件）、江苏众红生物工程创药研究院有限公司（16件）、华中农业大学（15件）、河南农业大学（15件）、佛山科学技术学院（14件）、天津市畜牧兽医研究所（14件）、黑龙江大学（13件）、湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心（13件）、武汉科前动物生物制品有限责任公司（13件）、中国农业大学（13件）、中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（13件）。

     整体上看，国内高校及科研院所的相关中国专利申请量居多（312件），这与我国研究重点还处于高校和科研院所阶段相联系，相关研究成果还处于实验室阶段，并没有完全、高效的转化为生产力。国内企业的申请量为58件，这些企业几乎都是生物公司，且都与高校或者科研院所有科研联系。从中可以发现，国内相关企业可以加强与高校和科研院所之间的横向联系，充分发挥产学研结合的作用，实现创新成果转化，抢占猪流感检测诊断技术的市场，推动这一领域的科技进步。同时，值得注意的是，国内个人的申请量为14件，这些申请虽然发明点较低，但也说明我国民间发明创造的热情，是我国科技发展中不可获取的组成部分。

     在相关中国专利申请中，国外企业来华申请占6.8%（26件），国外研究院所来华申请占0.7%（5件）。从中也可以发现，国外企业对中国市场的重视程度，而且随着知识产权意识在全球范围内的不断深化，这种重视程度会不断加强。同时，国外企业在全球范围内的猪流感检测领域专利布局也会不断加强，这种趋势需要得到我国相关部门重视。

     在猪流感防控技术领域，专利申请量居首的为猪流感治疗用药领域，其次为猪流感诊断与检测技术领域。目前，国际上公认对流感病毒有抑制作用的抗病毒化合物药物仅有少数几种。但作为中国传统文化，利用中药进行猪流感的预防和治疗是中国专利申请中的一个特色，而且所占比例达到40%，这也说明利用本国传统对现代疾病进行防控也是发展方向之一。作为中国传统文化的重要组成部分，中医中药理念不但不应该被舍弃，而应该使其在科技的进步中发挥其更重要的作用。

     至于检测和诊断方面，猪流感作为一种传染病，其防控主要涉及3个阶段：诊断、治疗及预防，其中快速检测、早期诊断是及时治疗的重要基础，也可为流行病学调查提供快速、灵敏的手段。另外，有资料显示，猪流感病原体的变异在明显加快，这也给猪流感病毒检测提出了更高的要求。考虑到这些因素，笔者锁定猪流感病毒检测这一技术主题作深入分析，以期为猪流感检测和诊断技术的研究和发展提供参考。

     猪流感病毒的基因突变率极高，尤其是其中的血凝素（HA）、神经氨酸酶（NA）基因极易发生点突变，导致其编码的蛋白氨基酸序列改变，从而逃避宿主免疫系统的识别和清除。猪流感病毒感染宿主后，其病理变化因感染毒株毒力的强弱、病程的长短和宿主的不同而有所不同，临床症状也表现各异，仅通过临床症状和流行病学特点很难对其进行确诊。目前，猪流感的检测方法可分为病原学检测、免疫分析技术和分子生物学检测3大类。在经典的流感病毒病原学检测方法中，鸡胚分离法操作方便、敏感性强、准确性高，通常被作为诊断SI的“金标准”，但病毒的分离鉴定需要将病料接种鸡胚或进行组织培养，耗时较长（几天到1周不等），存在滞后性，无法满足急性烈性传染病紧急疫情防治工作的需要；血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验可以确定“HA”亚型。这种方法主要优点是操作简单、快捷，特异性好，但由于一些动物血清中含有非特异性凝血因子，可能会造成假阳性。

     为了满足快速检测的需要，在现阶段，免疫分析技术和分子生物学检测技术在猪流感检测中发挥着主导作用。而在专利申请内容中，我国猪流感检测领域最主要的研究热点集中在酶联免疫吸附试验（ELISA）、RT-PCR技术、核酸探针技术、ELISA、基因芯片、环介导逆转录等温扩增技术6大方法上。

     在检测技术方面，国外的优势还是相对明显。采用感染性分子克隆技术得到的产物进行猪流感病毒检测的相关专利较多，采用多重或荧光定量PCR技术检测猪流感病毒的专利也占有一席之地，同时，还有采用微阵列技术、胶体金试纸条进行病毒检测的报道。相对而言，以美国、法国研究机构和企业为首的许多国外研究机构和体外诊断试剂开发企业，从检测的灵敏度、精确性等方面对使用ELISA技术检测诊断猪流感进行了深入研究。日本、新加坡等亚洲国家在猪流感检测技术及试剂盒的开发方面也表现不俗。现在国外的猪流感检测技术主要发展趋向为高通量、迅速、特异。国外猪流感疫苗相关专利多为基因工程类疫苗，例如具有标记功能的重组猪流感疫苗、采用反向遗传操作的猪流感病毒感染性分子克隆的构建，还有转基因植物疫苗也有专利报道。国外在猪流感治疗方面也侧重于利用分子生物技术进行相应的辅助治疗，包括植物提取物的免疫增强疗法和重组猪流感病毒疗法等。

     猪流感检测技术由最初的病毒分离与鉴定、经典血清学诊断方法，发展到更快速简便的免疫学和分子生物学方法，近几年又出现了融合多学科精髓的高通量芯片技术，使得猪流感检测技术逐步向着高灵敏度、高通量、更迅速、更特异、更简便的方向迈进。

     随着单克隆抗体筛选技术的不断进步，利用该技术为核心检测猪流感成为科研发展重点，包括以单克隆抗体建立的间接免疫荧光试验、胶体金法、ELISA法等。该技术的关键点在于抗体结合的特异性和敏感性，而由于样品中HA蛋白的抗原决定簇被包在蛋白结构内部无法接触到抗体，因此在使用单克隆抗体检测时往往需要将样品进行预处理，常见的是加热处理，使包埋的抗原决定簇暴露出来。但是同时也会带来检测程序的复杂化，延长检测时间的缺点。同时加热会导致样品中的其他各种蛋白变性，对检测结果产生噪音，导致检测的特异性降低。而在实际检测过程中，H1与H3亚型猪流感，特别是H1N1、H3N2和H1N2亚型猪流感是流行性流感病毒，在世界各地都有所分离。同时由于猪的“混合器”作用，可以同时感染禽源、人源流感病毒，而产生具有新抗原性、遗传特性、致病特性的基因重排病毒，进而使病毒可能突破种间屏障、扩大感染谱系，危害动物及人类健康。虽然人H1N1流感病毒被认为不能在猪体内繁殖长期存在、显现一过性感染，但近年从临床上也分离到了类人H1N1（Human-likeH1N1）亚型SIV。因此，如何在如此繁杂的混合病毒中更准确的检测相应的病毒成为现阶段此技术的发展重心。专利申请CN101974078A提供了一种特异性结合H1亚型猪流感病毒抗体，与其他病症相似的病毒抗体均为阴性反应，在检测时无需对待测样品进行过多处理即可方便地获得精确的检测结果，可以大幅度提升检测的便捷性和正确性。

     ELISA敏感性高、特异性强、操作简便，适用于大规模检测。目前我国研发的猪流感ELISA诊断方法包括猪流感病毒检测ELISA和猪流感抗体检测ELISA两种。目前，国内的主要申请重心为商业化的ELISA检测试剂盒，其申请人主要是与高校或科研院所合作的国内企业。虽然ELISA法用于流感病毒的检测方法发展迅速，已经成为一种比较成熟的诊断方法，但是作为免疫检测技术，还存在一定局限性，如血清中可能存在感染试验的因素干扰试验的结果。针对这一难题，湖南出入境检验检疫局检验检疫技术中心的专利申请CN102002480A，CN101988050A分别公开了抗H3N2，H1N1猪流感病毒血凝素蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒，所述ELISA试剂盒可特异地检测含有H3N2，H1N1猪流感病毒的待测动物抗血清，可检蛋白样本的OD值在0.056～0.093之间，能检测出2-1个HA单位的抗原，准确率可以达到100%。

     核酸探针杂交技术是目前生物化学和分子生物学研究应用最广泛的技术之一，是定性和定量检测特异性DNA或RNA的有力工具，为从分子水平探讨猪流感的发病机理和临床早期快速诊断提供了新的研究手段。为满足对流感疫情的早期控制预警的要求，该技术多结合基因芯片技术应用于猪流感病毒检测，实现高通量、大批次的检测效果。例如，专利申请CN102943129A提供了10条用于同时检测猪流感病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒和口蹄疫病毒的引物和多重连接探针，可同时对上述5种病毒进行检测、分型或鉴定，并能鉴别病毒的高致病性，大大缩短了流感病毒的检测时间，且提高了检测准确率。

     PCR是鉴定流感病毒基因组的一种很有效的方法，已成功用于动物流感病毒的鉴别诊断。在猪流感病毒的检测方面，主要是根据流感病毒NP基因、M基因保守序列，设计合成引物实现目的序列的扩增。在此基础上，实时荧光定量PCR是将荧光基团加入PCR反应体系中，利用荧光信号积累对整个PCR进程实时监测，该方法更多地被应用于病毒分型检测。例如A型和B型流感病毒的检测，通过检测流感病毒的M基因、HA基因来区别A和B型流感病毒，或用于区别A型流感病毒的亚型。随着2009年5月中国研究人员对甲型H1N1流感病毒部分基因组序列测定及分析工作完成，各科研院所和企业联合推出了一系列的诊断试剂和试剂盒。北京大北农科技集团股份有限公司在CN103014176A公开了一组用于猪流感病毒SYBGREENIReal-timePCR检测法的引物集，包括猪流感病毒通用型M基因、H1亚型、N1亚型、H3亚型和N2亚型引物，该引物适用于SYBRGreenI染料法，以降低SIV的检测成本，并实现对SIV的快速分型检测，为临床监测SIV疫情动态和流行趋势提供技术支撑。

     环介导等温扩增技术（loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）是2000年Notomi等建立的一种新的体外核酸扩增技术，该技术可以不需任何PCR仪和检测仪，通过具有链置换活性的DNA聚合酶的合成作用，在60℃左右的恒温条件下特异、高效、快速地扩增靶序列，不到1h就能扩增109倍，扩增产物可以直接观察。LAMP技术不但可以检测DNA，在反应体系中加入反转录酶后也可检测RNA，并且反转录和等温扩增可以在同一反应管中进行。建立能灵敏、特异性强地诊断猪流感病毒亚型的RT-LAMP方法的前提是针对病毒亚型基因亚型保守区设计特异性引物。中国兽医药品监察所的刘业兵等人在CN101629217A中针对上述需求，根据GenBank公布的SIV不同亚型的基因序列，针对PA序列相对保守区域设计了SIVRT-LAMP简并引物6条，以猪流感H1、H3、H5、H9亚型毒株为模板，建立了可以检测所有亚型猪流感毒的RT－LAMP方法。通过敏感性试验证明：本方法可对100TCID50SIV样品RNA进行10－4稀释后仍可高效扩增，显示出本方法高度的敏感性；通过特异性实验和19份临床样品的SIV病原的RT-LAMP检测，有5份样品检测到病料中SIV核酸为阳性，与RT-PCR、鸡胚分离结果一致，经基因芯片分型鉴定验证，综合结果符合率为100%。显示本方法特异、敏感、快速，适合用于各种试验条件下SIV的检测。

     基因芯片就是将大量已知DNA序列的探针通过一定方式固定于某种固相载体表面，形成致密、有序的DNA分子点阵。利用抗原抗体结合特性制备的蛋白质芯片技术不仅保留了抗原抗体反应快速、灵敏和特异性的特点，还可以满足生物样本多指标分析的需要，因此比较有利于大规模推广和产业化应用。但该技术的主要障碍就是筛选到敏感性好和特异性高的标志物，在混合样品中检测出目的致病源。山东澳兰生物工程研究院的专利申请CN1616682A中提供了一种用于诊断猪病毒病的基因芯片，其中包括：固定在固相载体上的与待检致病病原种类相对应的待测致病病原特征性DNA和/或cDNA片段，其中采用的特征性片段由猪瘟病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪流感病毒、猪细小病毒、猪呼吸道冠状病毒、猪轮状病毒、猪流行性乙型脑炎病毒病原基因特征性片段组成，可快速高效的对上述10种病毒进行检测，与现有技术中的病毒分离法、ELISA法相比较，符合率为96%。

     传统的诊断方法中由于猪流感病毒自身的变异特点，导致操作繁琐、费时，重复性差，限制了实际临床中的快速诊断，但传统的诊断方法由于效果直观在猪流感病毒的初次分离和亚型鉴定中起着非常重要的作用。随着分子生物学的发展，基于分子生物学原理建立的方法，为快速准确的诊断和监测猪流感提供了有效的方法。因此在今后的发展方向上，应把传统的猪流感诊断方法和现代的分子生物学诊断新技术有效的结合起来，为有效诊治和防制猪流感提供科学依据。迄今为止，我国尚没有统一的衡量猪流感病毒诊断试剂质量的标准。而该标准的建立则需要考虑灵敏度、特异性、检测效率、易用性等多方面。基于现有技术及相关重点专利文献技术信息给出的功效方面的优劣势对比结果，我们可以看到，单一的方法中LAMP法、RT-PCR法、ELISA法预计将成为下一阶段猪流感病毒检测技术的研发和应用重点，但如果想成为一种猪流感检测的“金标准”，尚需要对上述几种检测技术进行进一步的完善或者进行几种方法的融合，进行协同检测。

     此外，现有技术中尚有多种新兴的检测手段，例如，焦磷酸测序技术（pyrosequencing）。该技术是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与Sanger测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。该技术进行改进后可以满足上百个核着酸序列的测序工作，又可以满足对重要微生物的鉴定与分型、特定DIVA片段的突变检测和克隆鉴定等方面的应用。目前，我国己经有由山东出入境检验检疫局主持研究的《猪A型H1N1流感病毒焦磷酸测序方法》已通过国家标准化委员会的审定，批准作为国家标准予以推广应用，焦磷酸测序检测方法也是世界卫生组织（WHO）推荐的流感病毒快速确证方法，建议在全球范围内推广应用。但尚没有利用该技术进行SIV检测的技术方案申请专利的先例。

     猪流感作为猪的一种重要传染病，严重危害养猪业健康发展。尤其是近年来人流感、猪流感、禽流感呈现出混合感染、混合发病的趋势。其中猪作为流感病毒储存宿主和混合器的作用，已经引起了人们对公共卫生安全的高度重视。如何更好的合理利用知识产权，提升产业和行业的整体水平，需要政府与企业共同努力。生猪养殖作为我国战略性的稳定保证，需要更高效、完善的技术防护和支持，其中专利发挥的作用必定越来越重要。

     针对以上情况，我国应当将养殖产业发展与相关区域规划统筹考虑，尤其是在山东、浙江等农业生产大省，为生猪养殖及产品加工领域在立项、资金、税收各方面提供针对性的产业政策支持，需要建立以政务政策为导向的领域发展战略，进一步提升和稳定生猪养殖的战略地位，用技术为生产保驾护航。其次，应积极进行产业结构转变，从小规模、散户经营转化为大规模养殖场和生态养殖，从劳动密集型向资本密集型、环境友好型转变，这样既有利于产品品质的提升和稳定，又易于通过产量优势形成地区或企业优势，打造知名品牌，提升竞争力；再次，还应加大对猪流感防控相关产品的研究力度，延伸产业链长度，提升产品附加值；另外，应大力推进产学研一体化，企业领导人应该主动联系科研院所，多学习、多交流，使产业资本与高校和科研院所人才和技术的优势有效对接，加快产业发展速度。

（国家知识产权局专利局，吕健，黄蕊；中国农业科学院上海兽医研究所，高飞，袁世山，童光志）