猪细小病毒的初次分离一般选用猪肾原代细胞，也有见于使用PK-15细胞系和SK细胞。猪细小病毒为单股负链线性无囊膜的DNA病毒，病毒直径约为20nm，在发现猪圆环病毒之前，一度被认为是猪群中最小且最简单的DNA病毒。猪细小病毒感染可见于不同日龄的猪群，也有野猪感染猪细小病毒的研究报道。

     本研究设计针对猪细小病毒病毒VP2基因的特异性引物，通过PCR方法对分离的细小病毒株进行鉴定，证实分离到一株猪细小病毒，现报道如下。

     1.1病料收集与处理采集福建某猪场初产母猪流产胎儿的肾脏、脾脏、肠系膜淋巴结组织，剪碎后用研钵研磨处理，按照1:5比例加入含双抗（100IU/mL）的灭菌生理盐水进行匀浆，反复冻融4次，6000r/min离心30min后吸取上清液，冻存备用。

     1.2试验试剂2×TransTaq-TPCRSuperMix、蛋白酶K、RNaseA、克隆载体和JM109感受态细胞均购自北京全式金生物技术有限公司；RM-1640培养基和胎牛血清购自Gibico公司；常规化学试剂和药品均购自上海生工公司。

     1.3病毒接种将1.1项处理好的病料乳剂经0.22um过滤器过滤后，按照1.0%的剂量接种仔猪原代肾细胞，37℃温箱中培养24h，弃除细胞培养液上清，换成不含胎牛血清的RM-1640培养基，37℃温箱中连续培养，再连续观察5d。待接种的猪原代肾细胞出现细胞病变后，收获细胞液。将收获的细胞毒液在仔猪原代肾细胞上继续传3代，并检测其1.0%豚鼠红细胞血凝价。

     1.4病毒DNA的提取采用经改良的蛋白酶K乙醇沉淀DNA法，简要步骤如下：取细胞毒液490μL，往其中加入1%SDS10μL、蛋白酶K（20mg/mL）2μL后，于56℃水浴2h；往其中加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比为25:24:1），震荡后混匀，室温静置10min；12000r/min离心10min；小心吸取上清后再加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（体积比为25:24:1），震荡后混匀，重复离心操作一次；取上清后加入100μLNaAc（pH5.2，3M）和50μL异戊醇沉淀核酸，-20℃静置2h；12000r/min离心10min，用70%乙醇和无水乙醇各沉淀核酸一次；最后加入50μL灭菌去离子，37℃水浴10min后，置于-20℃备用。

     1.5PCR鉴定利用引物设计软件OLIGO设计针对猪细小病毒结构蛋白VP的特异性检测引物，上游引物序列为：5'-AGACTCAATACAAACAGGAC-TACA-3'；下游引物：5'-TTTAGTGGTGCCT-GTTGATTAAAT-3'，目的片段大小预计为558bp，引物由上海生工公司合成，引物合成后用灭菌去离子水稀释至终浓度10pmol备用。以1.4项中提取的猪细小病毒DNA为PCR模板进行PCR鉴定，扩增体系为50μL，其中2×PCRMix预混液25μL、上下游引物（10pmol）各2μL、DNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终体积50μL。反应条件为94℃5min预变性后进入循环，循环参数为94℃50s、54℃30s、72℃40s，40个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，取PCR产物5μL，在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。经胶回收试剂盒切胶回收纯化后与T克隆载体连接，转化JM109感受态细胞，提取质粒，经阳性鉴定后送由上海生工公司进行序列测定。

     1.6序列分析将1.5项的测序结果经拼接后进行BLAST数据库比对分析，与GeneBank中登录的猪细小病毒相关基因序列进行核苷酸同源性比较，并绘制系统发育进化树。

     2.1病毒分离病料接种猪原代肾细胞，传代5代后，第5代接种猪原代肾细胞84h后开始见有细胞病变，病变细胞呈现为圆缩、拉网丝状、最后见溶解脱落。经自制的1.0%新鲜豚鼠红细胞测定，第5代的血凝价可达27。

     2.2PCR鉴定PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，见有目的条带扩增，大小约为500bp，符合试验预期（见图1）。

    

     2.3克隆序列基因分析将测序结果通过美国国立生物技术信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）数据库利BLAST（BasicLocalAlignmentSearchTool）进行比对分析，结果同源性最高序列的均为猪细小病毒结构蛋白VP目的基因。克隆获得序列和德国健康猪体内分离的猪细小病毒80T株（GenBank号为KC296746）和37T株（GenBank号为KC296744）核苷酸同源性均最高，均高达99.7%。将测序拼接结果和GenBank中登录的猪细小病毒代表株基因序列绘制该基因的系统发育进化树，可见本试验猪细小病毒分离株和德国健康猪体内分离的猪细小病毒80T株和37T株处于同一遗传进化分支（见图2）。

     猪感染猪细小病毒（PPV）可导致妊娠母猪流产和死胎等，其临床表现症状较难与其他产检致病病原（如猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒等）特征相区别。对于猪细小病毒的分离，至今还是研究该病的基础，主要采集的病料多为流产死胎肝与肠系膜淋巴结等组织，接种特异性细胞（如猪肾细胞、PK-15等），可获得较高的病毒分离率。

     目前关于猪细小病毒的诊断方法有较多研究报道，除经典的血凝和血凝抑制试验、PCR法以外，近年来还有LAMP法、实时荧光定量PCR方法和IPMA方法等报道。本研究获得针对VP基因设计的引物，经扩增后的序列与德国猪细小病毒80T株、猪37T株核苷酸同源性均最高，均高达99.7%。绘制其相互之间系统发育进化树可以看出，本试验猪细小病毒分离株与从德国健康猪体内分离的猪细小病毒80T株及37T株处于同一遗传进化分支。

（福建省泉州市洛江区农业水务局，林川）