本研究利用已建立的同时检测3种病原的多重PCＲ方法对2011—2013年期间来自辽宁不同地区的送检样品进行检测，分析了几种猪常见繁殖障碍病原在辽宁地区感染分布情况，为辽宁地区猪重大疫病的发生起到风险预警的作用。

     2011年1月—2013年6月，在辽宁省16个市县地区的猪场和屠宰场现场采集病料(包括扁桃体、肺脏、脾脏、淋巴结等样品)，共收集3340份样品，送至本实验室检测。

     磁珠核酸提取试剂盒、ＲT－PCＲ试剂(包括TaqDNA聚合酶、ＲNaseInhibitor、dNTP、DL2000、AMV反转录酶、DL2000Marker)购于宝生物工程(大连)有限公司。无水乙醇、异丙醇等分析试剂均为国产分析纯试剂。ABI公司的AppliedBiosystems2720Ther-malCycler型PCＲ仪。美国UVP公司的BioSpectrum310/Lenovo/brother凝胶电泳图像分析系统，美国Thermo公司的KINGFISHEＲ/HP/HP1007全自动核酸提取工作站。

     组织样品经研磨后，反复冻融3次，然后以10000r/min离心10min，取上清液用Ambion的磁珠核酸提取试剂盒提取病毒核酸。提取程序如下:KF96孔板加样:A行孔中加入ＲNABindingBeads(ＲNA磁珠)10μL、Lysis/BindingEnhancer10μL、Lysis/BindingSoLutionConcentrate130μL和50μL弱毒疫苗样品;B和C行孔中加入150μL配制好的WashSoLution1Concentrate:D和E行孔中加入150μL配制的WashSoLution2Concentrate:F行孔中加入50μLELutionBuffer。然后将KF96孔板放入核酸提取仪中。反应完成后取F行孔中液体放入离心管中－80℃保存备用。

     多重PCＲ方法的引物:

     PＲＲSV上游引物:5'－ACCATGGAGGAGGATCT-GCTAAAAC－3'，下游引物:5'－CTGGTAAG-CAGACGTGTTGCG－3'，共扩增460bp;PCV2上游引物5'－CAGCAAGAAGAATG-GAAGAAGCGGA－3'，下游引物:5'－CAG-CAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA－3'，扩增1057bp片段;

     PＲV上游引物:5'－CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT－3'，下游引物:5'－CGTGGCCGTTGTGGGTCAT－3'，共扩增500bp。

     逆转录反应在20μL体系中进行，包括提取样品总ＲNA5μL，反转录溶液［50mmol/LTris－HCl(pH8.3)、75mmol/LKCl、3mmol/LMgCl2、10mmol/LDTT4μL、dNTP6μL、50pmol/LPＲＲSV反转录引物1μL、AMV反转录酶(200U/μL)1μL和ＲNA酶抑制剂(40U/μL)1μL，用DEPC水补足至20μL，42℃水浴1h，70℃5min。将反转录的cDNA于－20℃保存。

     PCV2、PＲV、PＲＲSV的PCＲ反应在25μL体系中进行，包括10×PCＲ缓冲液2.5μL，dNTP2μL，20pmol/L的PCV2、PＲV、PＲＲSV特异性引物各1μL，TaqTMDNA聚合酶1U，DNA或cDNA模板各1μL。反应程序:94℃5min;94℃45s，55℃(PCV2、PＲＲSV、PＲV)1min，72℃1min，最后72℃延伸10min。取10μLPCＲ扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

     对来自辽宁地区沈阳、大连、鞍山16个市县地区的猪场和屠宰场的样品，PＲＲSV感染情况见表1。2011年辽宁省PＲＲSV的阳性率为9.28%，2012年为27.3%，2013年上半年为0.6%，3年平均阳性率为12.1%。其中丹东和绥中地区PＲＲSV阳性率最高，分别为36.9%和57.1%。

     对来自辽宁地区沈阳、大连、鞍山16个市县地区的猪场和屠宰场的样品，伪狂犬病毒感染情况详见表2。2011年辽宁地区伪狂犬病毒的阳性率为0.4%，2012年为2.17%，2013年上半年为0%，3年平均阳性率为0.68%。其中来自本溪地区样品的伪狂犬病毒阳性率最高，为7%。

  

     对来自辽宁地区沈阳、大连、鞍山等16个市县地区的猪场和屠宰场的样品，猪圆环病毒2型感染情况详见表3。2011年辽宁地区猪圆环病毒2型的阳性率为59.2%，2012年为72%，2013年上半年为85.67%，3年平均阳性率为69.8%。其中来自鞍山、锦州、绥中和丹东地区的阳性率较高，均在90%以上。结果显示辽宁地区猪场的猪圆环病毒2型感染率非常高，并呈逐年上升趋势。

     对来自辽宁地区沈阳、大连、鞍山等16个市县地区的猪场和屠宰场的样品，3种病毒混合感染情况详见表4。2011年—2013年辽宁地区主要以猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染为主，3年的阳性率为分别为9%、42.2%及0.6%，只有2012年出现了3种病原混合感染的情况。

  

     目前PＲＲSV已在我国广泛存在，由于PＲＲSV除了引起妊娠母猪及哺乳仔猪严重发病导致死亡外，患病猪群还会因免疫抑制造成继发感染，加剧病情，使死亡率增高，给养猪业造成严重的经济损失。自郎洪武等首次从国内的病猪群分离到圆环病毒以来，国内不断有关于发现该病毒的报道，这几年各地也有关于PＲＲSV和PCV2混合感染的报道。

     本研究对2011年—2013年上半年来自辽宁沈阳、大连、鞍山等16个市县地区的猪场和屠宰场的样品检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型3种病原的感染情况，结果发现辽宁地区主要以猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒和猪圆环病毒2型混合感染为主，3年内最高的混合感染率达到42.2%，可见PＲＲSV和PCV2已经成为影响辽宁地区猪场疫情的主要病原。已有证据表明免疫系统的刺激对激发PMWS是一个重要的因素，PCV2具有免疫抑制特性，PCV2感染可以引起继发性免疫缺发病或感染猪至少有短暂的免疫抑制现象而使感染猪不能激发对其他病原体的有效免疫应答。因此认为PＲＲSV可能增强了PCV2的致病作用，从而使混合感染后的猪出现严重的症状。

(沈阳出入境检验检疫局，耿庆华，张侃;朝阳市双塔区动物卫生监督所，林松华)