剖检采集病死鸡肝脏组织作为细菌分离的材料，采集病死鸡气管、支气管、肺脏作为病毒分离的材料。

     普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基，细菌微量生化反应管和药敏纸片为杭州天和生物试剂有限公司产品。

     9日龄鸡胚购于昆明云岭广大种禽饲料有限公司。

     禽大肠杆菌标准O因子血清、抗新城疫(NDV)、抗减蛋综合征(EDSV－76)标准阳性血清及抗原购自中国兽医药品监察所。H5亚型禽流感标准阳性血清、H9亚型禽流感病毒标准阳性血清等均购于哈尔滨维科生物技术开发公司。

     无菌操作取病死鸡的肝脏划线接种普通营养琼脂、麦康凯琼脂培养基平皿，置37℃培养箱中培养18～24h。选择单个菌落接种普通琼脂平皿、麦康凯琼脂培养基平皿纯化培养24h。

     用接种环在载玻片上滴生理盐水，然后分别用接种环挑取普通琼脂平皿和麦康凯琼脂培养基平皿内纯化培养的单个菌落与玻片上的生理盐水混合，并均匀涂布于玻片上，自然干燥。分别进行美兰染色和革兰氏染色。

     用接种环挑取纯培养的待检菌落接种于各微量发酵管，倒置37℃恒温箱24h观察结果。

     从麦康凯培养基内挑取单个菌落均匀接种普通琼脂平皿内，用无菌小镊子夹取各种药敏纸片，平贴于琼脂表面，各距离相等。将贴好药敏试纸片的平皿翻转，将其倒置放入37℃恒温箱培养24h。平皿从恒温箱内取出后，观察药敏纸片周围有无抑菌圈形成，按抑菌圈直径的大小判定各药敏纸片上的敏感度。

     经形态学、培养特性检查和生化试验鉴定为大肠杆菌，分离株的血清型鉴定按中国兽医药品监察所提供的产品使用说明书进行操作。

     无菌采集病死鸡气管、支气管、肺脏组织，剪碎研磨后按1∶5比例加入双抗生理盐水制成悬液，置－20℃下反复冻融3次，3000r/min离心15min，取上清液用0.22μm除菌滤器过滤，滤液加双抗经绒毛尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚，共接种8枚，0.2mL/枚，石蜡封口，置37℃孵育，每8h照一次胚，弃去24h内非特异性死亡胚，收集24～96h死亡及未死亡胚的尿囊液，放置－20℃冻结保存备用。

     血凝(HA)试验:按常规方法，将收获的胚液(绒毛尿囊液与羊水)进行微量血凝试验，测定病毒的血凝效价。

     血凝抑制(HI)试验:按常规方法，将HA试验中有血凝活性的胚液分别与新城疫标准阳性血清、减蛋综合征标准阳性血清、H5亚型禽流感标准阳性血清、H9亚型禽流感标准阳性血清进行血凝抑制试验。

     分离菌在营养琼脂培养基平皿上形成圆形、隆起、光滑、湿润、灰白色的菌落。麦康凯琼脂培养基平皿上形成砖红色湿润的菌落。革兰氏染色镜检结果可见革兰氏阴性、两端钝圆的短杆菌，符合大肠杆菌的形态特征。生化试验结果显示，分离的6株细菌能100%分解葡萄糖、乳糖、甘露醇，不能分解肌醇，靛基质、MＲ、硝酸盐试验呈阳性，H2S、V－P、柠檬酸盐试验呈阴性。6株大肠杆菌O因子血清凝集试验，鉴定出2种血清型，其中O78有3株、O88有1株、2株自凝。药敏试验结果表明:分离株对丁胺卡那霉素、环丙沙星高度敏感，对庆大霉素、恩诺沙星、氧氟沙星、强力霉素、妥布霉素中度敏感，对头孢氨苄、新霉素、青霉素、链霉素、红霉素、阿莫西林、罗红霉素不敏感。

     病料接种10日龄鸡胚后，鸡胚48～72h未见死亡，全部鸡胚72h后4℃过夜冻存后无菌收获未死亡，鸡胚尿囊液，尿囊液清亮。剖检鸡胚，鸡胚全身弥漫性出血，头部和背部有出血斑点。

     将收获的鸡胚尿囊液胚液进行HA试验，结果显示，分离的病毒能凝集鸡的红细胞，病毒血凝价为8log2～10log2。

     病毒HI试验结果:该病毒样品不能被新城疫标准阳性血清、减蛋综合征标准阳性血清、H5亚型禽流感标准阳性血清抑制，只能被H9亚型禽流感标准阳性血清抑制，表明从病死鸡中分离出的病毒为H9亚型禽流感病毒。

     根据发病特点、临床症状、剖检变化、实验室检测综合分析，诊断为大肠杆菌和H9亚型禽流感病毒混合感染。

     全群用丁胺卡那霉素和金丝桃素饮水，连用5d，同时在饲料中加入多种维生素和适量葡萄糖及小苏打(0.2%)，连用7d进行辅助治疗。

     及时隔离病鸡，防止病原进一步扩散，鸡舍用含碘消毒液和过硫酸氢钾复合粉(卫可)交替喷雾消毒，1次/d。加强鸡舍保温和通风调节，及时清除病死鸡，并焚烧或深埋。

     鸡群适时补免注射H9亚型禽流感油乳剂灭活疫苗，注射剂量为0.5mL/羽。

     经采取以上措施，用药2d后病情逐渐好转，病死鸡数量明显减少，1周后鸡群产蛋率恢复至90%，略低于发病前。

     (1)通过病毒接种实验，鸡胚48～72h未见死亡，说明H9亚型禽流感病毒致病性不强，采取肌注等多种方式攻毒成年鸡，看不到H9的临床症状和剖检变化，证明分离到的H9亚型禽流感并不单独感染，只有继发或并发其他疾病之后才会表现出一些临床症状。

     (2)大肠杆菌是条件性致病菌，在大群饲养过程中，鸡舍地面潮湿、通风不良、拥挤的环境中容易诱发。机体在饲养环境差的情况下，鸡群的免疫力低下，容易诱发H9亚型禽流感等病毒性疾病。防制大肠杆菌病的关键在于加强饲养管理，鸡舍要经常保持清洁、干燥，料槽和水槽要注意经常清洗，做好各个环节的卫生消毒，消除各种发病诱因。日常要提供全价优质饲料，饲料中添加霉菌毒素吸附剂，并给以足量维生素和电解质，严格执行卫生防疫措施，创造一个良好的饲养环境。

     (3)鸡大肠杆菌和H9亚型禽流感病毒混合感染造成不同的死亡率和生产性能下降，致病机理可能是在鸡体内低致病性禽流感(H9)与禽致病性大肠杆菌之间有联合协同作用，H9可以对易感鸡的呼吸道造成损伤，有利于细菌侵入，还可能与细菌产生某些蛋白酶，使病毒的血凝素结构发生改变有关。因此，在防治措施上，最先要控制的是细菌感染，并采取综合防治措施，选择敏感的抗生素、抗病毒药及清热解表的中草药，同时运用才能有效控制病情的发展，迅速恢复生产性能。

(建水县动物疫控中心，谭红;云南省畜牧兽医科学院，张汝，常志顺，王传禹)