从南洋猪场中选取典型传性萎缩性鼻炎病猪，用酒精棉球彻底消毒鼻镜后，将棉拭子插入鼻腔至第一臼齿处，采取鼻腔内分泌物，共采取10头份样本，并迅速送至实验室进行细菌的分离和鉴定。

     血清肉汤培养基（MH）、鲜血培养基、马铃薯培养基和生化试剂均按常规方法制备。

     试验动物为体重20g左右的小白鼠和成年家兔，由亭湖区检测中心提供，健康妊娠母猪由病料来源猪场提供。

     氨苄西林、头孢曲松钠、头孢噻呋、链霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、土霉素、红霉素、林可霉素、磺胺六甲氧嘧啶、环丙沙星、恩诺沙星、痢特灵、呋喃妥因等15种药物均由恰威斯生物技术有限公司提供。

     在麦康凯琼脂中无菌加入葡萄糖（20mg/ml）、呋喃唑酮（25g/ml）、两性霉素（5μg/ml）作为分离培养基。将采取的鼻腔棉拭子接种于分离培养基，37℃培养48h后观察菌落形态，并与阳性血清进行平板凝集反应，2min内凝集的菌落为初选菌并分别接种于7%鲜血琼脂和营养肉汤斜面培养基，培养48h后4℃冰箱保存，以备进行各种理论检验。

     将初选菌种接种于麦康凯琼脂和7%鲜血琼脂培养96h，观察菌落的形态和溶血性。亚硝酸钾和氯化钠耐受性检验是将其在分别添加2%亚硝酸钾的血液琼脂和6%、7.5%、9%氯化钠的营养肉汤中培养7d，观察其生长情况。所有的生化反应均参照Cowan的方法进行，Bb的判定参照Pittman的方法进行。

     将采取的鼻腔棉拭子接种于7%鲜血琼脂平板，37℃培养18～24h后进行革兰氏染色，观察菌体形态。将疑似菌落接种于血液琼脂斜面培养基，以备进行各种理化反应。所有的生化反应均参照Cowan和Carter的方法进行。

     分别将Bb、Pm移至7%鲜血琼脂斜面上，作为纯菌种。

     用接种环节钩取适量Bb菌株，划线于马铃薯琼脂平板表面，37℃培养20～22h，以灭菌生理盐水洗下菌落作为种子，再均匀涂布于马铃薯琼脂平板表面，37℃培养20～22h，以灭菌生理盐水洗下菌落，置于灭菌瓶中，用麦氏比浊管测定其含菌数。

     用接种环钩取适量的Pm菌株，划线于7%鲜血琼脂平板表面，37℃培养20～22h，以灭菌生理盐水洗下菌落作为种子，再均匀涂布于7%鲜血琼脂平板表面，37℃培养20～22h，以灭菌生理盐水洗下菌落，置于灭菌瓶中，用麦氏比浊管测定其含菌数。

     分别取Bb、Pm的菌株培养液混合，以灭菌生理盐水稀释至含每种细菌数均为100亿/ml。加入福尔马林使其在菌液中的最终浓度为0.4%，37℃灭活48h，其间不断摇动。灭活后的菌液缓缓加入到一定量的蜂胶中，加的过程中不断用玻璃棒搅拌，最后加入柳硫汞钠使最终浓度为0.01%，混匀、分装。

     肉眼直接观察灭活苗性状；混匀并取适量灭活苗，均匀涂布于鲜血琼脂平板上，37℃培养3d后观察。

     取10只小白鼠，分别皮下注射菌苗0.1ml/只，观察1周内生长状况；取10只家兔，皮下注射灭活苗2ml/只，观察2d，期间每4h测1次体温；妊娠母猪10头，产前15d左右，肌肉注射5ml/头，观察。

     选择健康的妊娠母猪，随机分为3组。第1组用本场灭活苗免疫，产前15d肌肉注射3ml/头；所产仔猪在7～10日龄、25～28日龄各接种1次，1ml/次，肌肉注射。第2组用市售蜂胶苗进行免疫作对照。第3组不免疫作对照。每天观察试验母猪所产仔猪，记录仔猪传染性萎缩性鼻炎发生情况和仔猪发育情况，综合判定灭活苗的免疫效果。

     将滤纸用打孔机打成直径为6mm的圆片，每100片放入一小瓶中，160℃干热灭菌1～2h。无菌将欲测抗菌药物溶液（磺胺类药物10mg/ml；其他抗菌素1mg/ml）1ml加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1～2h，用培养皿烘干法干燥。将制好的各种药敏纸片装入无菌小瓶内，置冰箱内保存备用。

     分别用活化后的不同菌株，接种于2mlMH肉汤，37℃培养（18±）h，稀释菌液，使其含菌量为1.5×107CFU/ml。

     用受试菌液均匀涂布于营养琼脂平板上，摆上药敏纸片，置于37℃培养（18±）h，测量抑菌圈直径大小。

     根据药敏纸片周围无菌区（抑菌区）的大小，测定其抗药程度。判定标准：抑菌环直径在11～15mm为中度敏感；抑菌环直径＞15mm为高度敏感。

     依据药敏试验选用高敏药物，对个别患有传染性萎缩性鼻炎的猪注射头孢曲松钠，1次/d，连用4d；同时，1t饲料中添加磺胺六甲氧嘧啶400g、磺胺增效剂80g、小苏打粉450g，饲喂3～4周。

     从10头份的鼻腔棉拭子中均匀分离出波氏杆菌和巴氏杆菌。对分离菌株的形态与培养特性进行鉴定。均分别符合Bb和Pm的特征。

     分离的Bb均有溶血现象，同时，过氧化氢酶，氧化酶，尿素酶，柠檬酸酶，6%、7.5%、9%氯化钠试验和石蕊牛乳试验均为阳性；果糖、半乳糖、葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖试验和亚硝酸钾试验均为阴性。

     分离的Pm经过氧化氢酶、氧化酶、尿素酶、吲垛、硫化氢试验，硝酸盐还原试验，葡萄糖、半乳糖、蔗糖、山梨醇试验均为阳性。麦康凯培养基生长性、运动性、溶血性为阴性，M·R、V-P反应，明胶液化试验，乳糖、棉子糖试验为阴性。

     灭活苗静置后分层，上层为淡黄色澄清液体，下层这深黄色沉淀物，振摇混匀呈均一混浊液；培养基上无任何细菌生长。

     20只小白鼠7d内均健活；10只家兔均没有体温升高；产前15d妊娠母猪注射7d后，未出现异常反应，胎儿、新生仔猪均正常。

     用本场灭活苗和市售灭活苗分别免疫妊娠母猪及其所产的仔猪，观察其对猪在生长过程中的保护情况

     Bb药敏试验：15种抗生素中对头孢曲松钠、头孢噻呋、氨苄西林、链霉素高度敏感；对环丙沙星、恩诺沙星、丁胺卡那霉素、庆大霉素、土霉素、林可霉素、新霉素中度敏感；对磺胺六甲氧嘧啶、红霉素、痢特灵、呋喃妥因耐药。

     Pm药敏试验：15种抗生素中对头孢曲松钠、链霉素、磺胺六甲氧嘧啶高度敏感；对头孢噻呋、氨苄西林、丁胺卡那霉素、庆大霉素、环丙沙星、恩诺沙星、红霉素、痢特灵、呋喃妥因中度敏感；对土霉素、林可霉素、新霉素耐药。

     对45头患病仔猪，按照本文方案采用高敏药物治疗，无死亡，淘汰5头，其余的全部康复，治愈率为88.89%。

     单独妊娠母猪免疫接种，免疫母猪的初乳中抗体效价可达17%log2以上，通过初乳抗体被动保护仔猪，在生后（吃初乳）4h即可在鼻腔中出现被动抗体，对鼻腔感染的局部保护力维持约2周。但被动保护力持续时间很短。学者认为仔猪免疫接种无效，这可能是由于污染群中母猪的初乳中有一定水平的抗体，对仔猪早期疫苗注射的免疫应答有一定的干扰作用。日本北里研究所建议：给免疫母猪所产的仔猪在5周龄第1次注苗，1周后注射第2次。而本试验采用母仔结合免疫取得良好的效果，一方面，与蜂胶佐剂有关，蜂胶不仅对母源抗体的干扰作用不敏感，而且还能全面启动机体的免疫防卫系统，剌激机体细胞免疫、体液免疫、红细胞免疫系统和巨噬细胞、补体系统都能产生免疫应答案；另一方面，可能与蜂胶苗的抗原剂量有关，其免疫机理还有待进一步研究。

（江苏省盐城市亭湖区南洋镇，李树兵；江苏省盐城市亭湖区便仓镇，卞成庆；江苏省盐城市亭湖区，陈金良）