2012年1月下旬，北京某猪场暴发一起仔猪腹泻病，死亡1000多头1周龄以内哺乳仔猪。为了查明腹泻的原因，诊断为猪轮状病毒和大肠杆菌混合感染，现报道如下。

     1.1临床调查和病理学观察观察病猪临床症状和剖检病理学变化。取其空肠和回肠用10%福尔马林固定24h，石蜡包埋切片，H.E.染色，光学显微镜下病理组织学观察，图像分析系统（美国，IImagePLUS）采集图像。

     1.2.1细菌分离及纯化取1周龄内哺乳仔猪肺脏、肝脏、肠用TSA血清琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基、三糖铁琼脂培养基进行细菌培养，37℃培养过夜，挑取优势菌落进行革兰染色。

     1.2.2药敏试验取200μL菌液滴入TSA营养琼脂平板上，用三角玻璃棒涂布均匀后，无菌镊子夹取猪场常用的抗菌药敏纸片，如阿莫西林、恩诺沙星、舒普深（头孢哌酮钠舒巴坦钠）、菌必治、链霉素、氟罗沙星、庆大霉素等，按纸片距离大体相等后放好，将平皿倒置，37℃温箱中培养18～24h，观察结果。

     1.2.316SrRNA检测挑取纯化三代的单个菌落，煮沸制备细菌DNA模板，离心1min后取1μL上清作为模板，利用细菌16SrRNA通用引物(PR16:5′-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；PR17:5′-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3’)，使用20μL扩增体系进行反应，PCR反应条件：94℃预变性5min；按94℃1min，52℃1min，72℃1min的顺序，30个循环后，72℃再延伸10min。反应结束，取少量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳观察结果。测序结果利用DNAStar软件进行同源性比较分析。

     1.3.1病料样品处理采集自猪场临床表现为腹泻和脱水严重的仔猪粪便及十二指肠、空肠，加入灭菌PBS(pH值7.2)制成1∶5的组织匀浆，反复冻融3次，8000r/min离心10min，吸取上清液备用。

     1.3.2病毒PCR检测根据文献报道，分别合成针对流行性腹泻病毒（PEDV）、传染性胃肠炎病毒(TGEV)及轮状病毒(RV)检测引物（PEDVF：5′-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3′；PEDVR:5′-CATATGCAGCCTGCTCTGAA-3′；TGEVF:5′-GTGGTTTTGGTYRTAAATGC-3′；TGEVFR：5′-CACTAACGTGGARCTA-3′；RVF:5′-GGCTTTWAAACGAAGTCTTC-3′；RVR:5′-GGTCACATCCTCTCACT-3′)，取处理好的样品进行病毒RNA的提取，参照试剂盒说明书提取总RNA，之后按照RNA反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。将反转录后的产物作为模板进行PCR反应，扩增条件为94℃5min预变性后进入循环，循环参数为94℃45s，55℃45s，72℃90s，35个循环后，72℃延伸10min。扩增产物进行纯化和测序。测序结果利用DNAStar进行同源性比较分析。

     1.3.3轮状病毒胶体金检测利用商品化的轮状病毒胶体金试纸卡(上海快灵生物科技有限公司生产，批号LN:G100625306)进行轮状病毒抗原检测。

     2.1病猪临床症状及病理学观察此次暴发的腹泻病猪多为1周龄内的仔猪，死亡率约为20%（60/300头）。病猪表现精神沉郁，食欲不振，拉黄白、水样、絮状稀粪，偶尔发生呕吐，腹泻愈久，脱水和高死亡率越高（见中插彩版图1A）。患猪用各类抗生素治疗无效。猪场观察到，有1头母猪分娩14头仔猪，5日龄时仅剩1头仔猪。死亡13头。本病的特征性病变主要位于消化道，以小肠的变化最明显。眼观胃壁弛缓，内充满凝乳块和乳汁。肠道臌气，部分空肠和回肠肠壁菲薄，半透明，肠内容物为浆液或水样液体，肠黏膜易脱落。肠系膜淋巴结充血、肿大，多呈浆液性淋巴结炎的变化。胆囊肿大，胆汁颜色较深（见中插彩版图1B）。

     病理切片镜检，以空肠和回肠的病变最为明显。其特征为绒毛萎缩而隐窝伸长。肠腔内积有多量脱落的上皮细胞和炎性渗出物。黏膜下层水肿、增厚，炎性细胞浸润（见中插彩版图1C)。小肠绒毛明显缩短、变平，常有融合，黏膜皱襞顶端绒毛萎缩更为严重，上皮由柱状变为立方形或扁平状，胞浆中出现小空泡发生变性变化。随着病情的发展，绒毛吸收上皮变性、坏死，黏膜固有层中淋巴细胞及网状细胞增多。固有膜毛细血管高度扩张、充血，并伴有轻微出血，严重者黏膜上皮大量脱落，裸露出固有膜（见中插彩版图1D）。

     2.2.1细菌分离取仔猪肺脏、肝脏、肠用TSA血清琼脂培养基进行细菌培养，37℃恒温培养24h后，见有白色、隆起、光滑的黏稠菌落。用取菌落涂片革兰染色镜检，可见两端钝圆，散在的红色小杆菌。随即从TSA琼脂平板上再次取菌落划线接种到麦康凯培养基上，置37℃培养箱中，培养24～48h，可见呈红色、隆起、光滑湿润型菌落。分离菌在三糖铁琼脂斜面上生长，产酸，使斜面部分变黄，穿刺培养，于管底产酸产气，使底层变黄且混浊，不产生硫化氢，初步判断分离细菌为大肠杆菌。

     2.2.2药敏试验结果分离的病原菌对舒普深与菌必治敏感，而其他药物氟罗沙星、阿莫西林、恩诺沙星和庆大霉素不敏感。

     2.2.3细菌的16SrRNA检测结果对细菌16SrRNA基因特异性片段进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，在大约750bp处可见清晰条带。基因序列测定获得了750bp片段与GenBank已公布序列进行对照。GenBankBlast分析发现该核苷酸序列与菌株E.coilO157(No.KF225555):H7，E.coilam-BH12(KC017347)，E.coilE112(JX267124)16SrRNA的部分基因序列同源性均达到99%，表明分离菌株为大肠杆菌。

     2.3.1病毒PCR检测结果显示PEDV及TGEV检测均为阴性，轮状病毒检测为阳性，获得扩增片段大小为333bp。测序结果显示，该毒株与印度报道A型人轮状病毒分离株G9(No.EU753964)VP6部分基因核苷酸同源性最高，为98.0%；与其余A型轮状病毒报道株(No.GQ149095、KC579873、KF041434)核苷酸同源性为均在97%以上；与猪轮状病毒(No.D00326)核苷酸同源性最高，为91.3%，与其他猪轮状病毒(No.JN034041，KF303566，KC113249，JF970185)同源性在85%以上。2.3.2胶体金试纸条检测利用轮状病毒胶体金试纸条检测结果为轮状病毒阳性。

     实验室诊断结果显示，此次京郊猪场暴发仔猪腹泻的病原为大肠杆菌及轮状病毒混合感染。根据药敏试验结果对发病仔猪进行治疗，舒普深和菌必治治疗效果较好，并逐渐痊愈，说明可能是大肠杆菌单纯感染。当部分仔猪出现猪轮状病毒与大肠杆菌混合感染后，药物的敏感性降低，从而导致哺乳仔猪死亡率增高。原因是猪轮状病毒与致病性大肠埃希菌混合感染时，由于二者在致病过程中相互促进，可使更多毒素进入细胞，导致细菌和毒素吸收增加，引起败血症，成为仔猪死亡率增高的一个重要原因。对此，MelinL也有过报道，断奶仔猪单独接种轮状病毒或β产肠毒素大肠杆菌可能会导致短暂的腹泻或几乎不产生腹泻，然而，先接种β产肠毒素大肠杆菌，然后再接种轮状病毒，就会使β产肠毒素大肠杆菌增殖，加重腹泻程度，并使腹泻时间延长。

     目前尚无特效疫苗和治疗药物。对发病的仔猪，控制其感染的首要措施是加强母猪的饲养管理，适当增加母猪的蛋白能量饲料；提早诱食，仔猪一般从出生后第5天开始试喂，每头仔猪日补料量不超过50g，并提供充足干净饮水。治疗时可采用支持疗法，通过改善管理措施和应用抗生素来降低由轮状病毒和继发细菌感染引起的死亡率。饲喂含葡萄糖甘氨酸的电解质溶液，以最大限度地减少由轮状病毒感染引起的脱水和体重减轻。口服L谷氨酰胺可促进空肠对钠离子和氯离子的吸收。猪场用药情况表明，口服鞣酸蛋白和阿司匹林对降低轮状病毒的发病率和死亡率有一定效果。

（北京农业职业学院，王振玲，王金秋，段素云；北京伟嘉集团创新研究院，章丽娇；中国农业大学动物医学院，李爽）