截至2006年初，小反刍兽疫（PPR）在我国西藏、云南、广西毗邻国家频频发生，2007年7月，我国西藏首次发现小反刍兽疫疫情。2013年12月到今年3月31日，我国已发生疫情7起，约7414只羊被捕杀和无害化处理。

2.1 初步诊断根据动物发生的流行病学特点、临床症状和病理变化可做出初步假设性诊断，同时注意与牛瘟、蓝舌病、口蹄疫、山羊传染性胸膜肺炎、巴氏杆菌病、羊传染性脓疱病等相区别。

2.2.1 病毒分离培养。采取病畜的眼结膜、鼻腔、口腔及回肠、直肠黏膜等部位的分泌物棉拭子，或者采集血液标本，也可剖检采集淋巴结、扁桃腺、脾、肺、大肠等组织块，以干冰或冰袋冷藏输送至实验室，然后用原代绵羊或者山羊胎肾细胞、新生羊睾丸细胞或非洲绿猴肾细胞（Vero）对病毒进行分离培养。PPRV产生细胞病变（CPE）要在接种细胞培养后5～6d出现，其特点是出现多核细胞，有的出现核内包涵体，部分细胞形成空泡。后来有学者研究发现，利用E-B病毒改造过的狨猴B淋巴细胞衍生细胞系Marmo-setB95a更利于PPRV的繁殖及分离，可代替Vero细胞。这一发现对PPRV的研究非常有用。

2.2.2 琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID）。首先从病畜肠系膜或支气管淋巴结、脾脏或肺组织获取抗原，以5mL含104TCID50/mL的PPRV高免绵羊，提取血清制备抗血清。ObiTU等采用PPRV的细胞适应毒接种用兔子制备的抗PPRV高免血清进行AGID试验，结果这种高免血清能够与麻疹病毒属的其他三种病发生交叉反应，但是如果将其进行1∶100稀释以后，则仅和其同源的PPRV呈阳性反应。可见，AGID试验的敏感性不足以检测到分泌物中的微量抗原，这是一种相对简单、快速和廉价的检测方法，因此也就不能对疾病做出早期诊断。

2.2.3 对流免疫电泳（CIEP）。ObiTU等采用CIEP和AGID同时检测感染了PPRV的病料，试验结果显示CIEP的敏感性显著高于AGID。二者对所检测样品的阳性率分别为80.3%和42.6%，鉴于CIEP较高的敏感性，因此在无条件进行ELISA的地区或者实验室，CIEP可作为一种有用的筛选诊断方法，用于对PPRV进行临床检测，但是CIEP试验的缺点是不能区别牛瘟病毒（RPV）感染。

2.2.4 间接免疫荧光抗体试验（IFAT）。SumptionKJ等应用PPRV的特异性单克隆抗体建立了IFAT方法，结果能够检测出PPR感染发病早期和后期病料中的病毒抗原，并且能够快速对PPR和RP进行鉴别诊断。另外，以重组PPRVF蛋白为抗原免疫家兔，制备多克隆抗体，以制备的多克隆抗体为一抗，用于捕获病料中的抗原，以羊抗兔IgG为二抗，通过IFAT能特异性地诊断出PPRV。

2.2.5 病毒中和实验（VNT）。VNT是一种灵敏和特异的检测方法，通常是在原代羔羊肾细胞或非洲绿猴肾细胞中进行转管培养，在国际贸易中，这是指定的诊断方法。VNT具有很强的特异性，可以鉴别PPRV和RPV，也可以鉴别PPRV不同毒株之间的差异。但是VNT也存在明显的不足：耗费时间较长，一般需要10~12d才能得到结果；需要细胞培养病毒及无菌的试验样品；劳动强度大，很难实现大规模样品的监测。

2.2.5.1 竞争ELISA（c-ELISA）。c-ELISA是OIE的标准检测方法之一，动物感染PPRV后，其血清抗体一部分是针对PPRVN蛋白和H蛋白的，c-ELISA检测方法即基于此单克隆抗体而建立。该方法较传统VNT更加方便快捷，适用于野外大量样品的诊断，但无法鉴别诊断PPRV和RPV。由于感染PPRV的底物血清中有相当一部分是针对N蛋白和H蛋白的抗体，因此已经研制出许多直接针对PPRV和RPV的N、H蛋白的竞争ELISA试验方法。c-ELISA方法耗时较短，能实现检测的大量化，敏感性为94.5％，特异性为99.4％，与经典的病毒中和试验具有较高的相关性，因此得到广泛应用。现已开发出标准c-ELISA检测试剂盒，用于检测血清或者血浆中的PPRVN蛋白抗体。

2.2.5.2 间接ELISA（i-ELISA）。间接ELISA方法就是将抗原吸附在酶标板上，然后加入PPRV病毒特异性血清，孵育，最后加入酶结合物和底物，检测血清中的特异性抗体。由于PPRVN蛋白的454~472位氨基酸序列具有非常强的免疫原性，而且是PPRV特异的，其线性B细胞表位位于452~472位区域，针对这一区域的多肽抗体能特异性识别PPRV，于是Balamurugan等用其进行了i-ELISA试验，结果鉴别诊断出了PPRV和RPV。Zhang等克隆了在中国西藏暴发的PPRVN蛋白基因，并在大肠杆菌中表达，以此建立i-ELISA方法，在分析697份血清后，证明其敏感性和特异性分别达96.7％及96.1％。i-ELISA的特异性和敏感性均高于c-ELISA及VNT，说明i-ELISA可替代c-ELISA用于PPRV的流行病学研究，但是这种方法容易受到待检材料中其他蛋白的干扰。针对这一问题，可用免疫捕获ELISA（即夹心ELISA）方法进行更为精确的检测。

2.2.5.3 夹心ELISA（S-ELISA）。夹心ELISA是将待检样品首先和特异性抗体反应形成免疫复合物，这种复合物随后被预先包被在酶标板上的二抗（捕获抗体）所结合，再按常规的方法加酶结合物和底物等进行检测。Singh等针对PPRN蛋白表位的单抗（clone4G6）建立了诊断PPR的S-ELISA，结果表明，S-ELISA特异性达92.8％，敏感性达88.9％，2h内可获得试验结果，特别适合临床样品的检测，缺点是不能鉴别诊断RPV。由于S-ELISA具有迅速、简单的特点，因此可替代VNT用于PPR疫苗的质量控制。

2.2.5.4 阻断ELISA（B-ELISA）。Saliki等在1993年研制出了针对PPRVH蛋白的阻断ELISA检测方法，这种方法的原理和竞争ELISA基本一致，都是两种抗体竞争性地结合抗原的同一表位。但是在c-ELISA中，实验血清和检测抗体是混合在一起与抗原结合，而B-ELISA是先将实验血清和抗原反应，然后再加入检测单抗，这样所用的时间要比c-ELISA方法长一些。

2.2.6 核酸探针杂交实验。该方法的基本原理就是两条互补单链核苷酸通过氢键结合形成稳定的双链结构，其中作为探针的单链必须用32P或地高辛等进行标记，以检测可与其互补形成双链复合体的PPRV基因序列。针对PPRVN蛋白基因的cDNA探针，可以鉴别诊断PPRV和RPV。但是32P同位素的半衰期较短，且放射性元素对人体健康有害，还需要专门的设备与防护，故不能普及应用。

2.2.7 聚合酶链式反应（PCR）。1995年，Forsyth等首先建立了RT-PCR鉴别诊断方法。随后Georg等建立了多重RT-PCR方法。研究证实，PPRV的M基因对此法敏感性最高，N、H、F基因依次次之，可以鉴别诊断PPRV和RPV。在此基础上，Couacy-Hy-mann等（2002）作了进一步改进，利用Yamada等（1990）建立的玻璃乳浊液RNA提取技术可以在30min内从被感染细胞中抽提出总RNA，然后进行RT-PCR。他们设计的引物针对编码病毒核衣壳蛋白RNA的3′端约350bp的片断，最后结合同位索探针检测，其灵敏度为传统方法的1000倍，但是该方法属于两步法RT-PCR，逆转录和PCR反应分别在不同的管子中进行，其主要缺点是样品转移过程中容易造成污染而呈抗假阳性。Balamurugan等又发展出了更精确的一步法多重RT-PCR，利用单管一步法同时扩增出PPRVN基因上一个337bp的片段和M基因上一个191bp的片段，而RPV只能扩增出N基因的337bp片段，由于片段的差异，可以通过凝胶电泳或者酶切清晰地区分。与两步法相比，一步法由于所有反应都在单管内完成，从而简化了操作步骤，减少了可能的污染。但是，该方法仍然需要通过电泳来检测PCR产物，此过程又可能由于交叉污染而导致假阳性，而且费时、费力。

    国家外来动物疫病诊断中心包静月等建立了一步法实时定量RT-PCR。该方法的主要优势是快速，从逆转录、PCR到PCR结果报告，整个过程不到3h就完成。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析，设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测，都获得了特异性扩增。本方法具有高度灵敏性，最低可检测到810拷贝的RNA模板，在模板浓度为8.1×102～8.1×108拷贝范围内，都呈现出良好的线性关系，而且无论是组内或组间重复，其变异系数都很低。利用这一方法还可以对病原进行定量分析。此外，DilloA等根据病毒N蛋白基因3′端序列的保守性较差这一特点，设计了一对引物，成功扩增了300bp的一个片断，然后用限制性内切酶消化或用非放射性的寡核苷酸探针杂交技术对PPRV进行特异性鉴定。这种PCR和核酸探针杂交技术相结合的方法既敏感又快速，包括提取RNA，不到5h即可完成。

2.2.8 PCR-ELISA。2004年，Saravanan等发展出了一种高灵敏度的基于PPRVN基因的PCR-ELISA检测法。首先通过RT-PCR产生一个异羟基洋地黄毒苷元标记的336bp扩增产物，该序列来自PPRV的N蛋白基因，然后再用ELISA方法进行检测。2010年Saravanan等又将引物用地高辛进行标记，扩增的片段与特异的生物素标记探针杂交后，用针对抗地高辛的单抗进行ELISA检测。其灵敏度为传统PCR方法的10000倍。在临床试验中，采用传统夹心ELISA检测为阴性的样品，也能被该方法测出，它比夹心ELISA更适于检测早期感染的病毒，同时能够有效区分PPRV与RPV。

    目前我国很多省出现了PPRV的感染病例，且传播速度很快，造成大批羊只死亡，经济损失巨大。因此，建立一个方便、快速、安全、敏感、特异的检测方法对于该病的研究和预防控制具有极其重要的现实意义。