家畜精液检测技术要点与质量控制

    在畜牧业生产中，人工授精作为一项先进的实用技术得到应用和推广，而使用的精液质量可直接影响到推广的效果，目前世界任何一个畜牧业先进国家都将种畜精液质量安全列入监管范围。目前实验室进行的检验测试(以下简称检测)，主要有精子活力、每个输精剂量中呈直线前进运动精子数、精子畸形率、精子顶体完整率、精子存活时间等，为提高检测结果的准确性与可靠性，针对目前国内该领域的一些实际情况，就精液检测内容，提出了检测技术要点及管理上的质量控制，以保证检测结果的准确与可信。

1精子活力
    精子活力(SpermMotility)是指在37℃环境下前进运动精子占总精子数的百分率，这已界定了与精子活率的概念区别。家畜精子和卵子的受精部位在输卵管壶腹部，也就是说精子进入生殖道后仍需向受精部位运行，其动力一是依靠生殖道的收缩辅助，另一是精子自身的活动力，同时精子也需经过一个获能”的变化，因此要完成上述全部过程，对输入母牛生殖道内的精液中，必须要有一定比例(数量)生命力强的精子，评价这些精子的表现是呈直线前进运动。
1.1检测方法
目前主要方法是目测(人工)和计算机(分析软件)检测。
1.1.1目测(人工)法
    需要使用仪器有显微镜(配置相差镜头)或者电视显微录像系统和恒温载物台。检测时，取精液样品约10μL置于载玻片上，加盖玻片立即在显微镜下观察活力，也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力。精子呈立体状，每样片观察3个以上视野，并应观察不同液层内的精子运动状态，进行全面评定，至少观察二个样片。
1.1.2计算机(分析软件)检测
    计算机通过对摄录的精子运动轨迹的进行分析，给出呈前进运动精子的百分率。
1.2两种方法的比较
     目测(人工)法在畜牧业生产上仍是主流，该法主要缺陷是容易受到检测人员的主观因素影响，而且检测技术人员需要多年的经验积累;计算机(分析软件)检测，缺陷主要是经费投入较高，有时会因为在观察样品视野中存在一些细胞碎片或杂质类，导致计算机误认误判。
近期国内一些研究人员和检测人员进行了试验比较，计算机的评价结果比目测(人工)结果平均高出10个百分点左右，这除了可能存在计算机软件调试(最佳状态)和目测(担心误判评分过紧)的主观因素造成，其他影响因素，还需进一步试验分析。
1.3技术要点
    显微镜配置相差镜头，观察时镜下活体细胞呈立体状，便于观察、判别，观察倍数选择200～400倍，这是是目测的最佳倍数。对于载、盖玻片的选择应注意到厚薄程度，最好是载玻片厚度1mm、盖玻片厚度0.5mm，这样可以保证观察样品面的均匀。观察样品的取样量约10μL，这涉及观察样品面的厚薄，有利于观察。载物台温度(38℃)是为了确保载玻片上的观察样品是在37℃环境中。对于密度大的精液(大约在1亿/mL以上的)，可用稀释液或生理盐水适当稀释。

2每剂量中前进运动精子数检测
    前进运动精子数(ProgressiveMotility)是指在人工授精的情况下，每输精剂量中呈前进运动精子数(总精子数×活力%)。虽然受精时只能有一个获能精子，但也必须有一定数量的获能精子协同，以便使有更多的机会与卵子相遇，而且由于卵子外周的面积较大，更成为多数精子众矢之的。所以没有一定数量的精子参与受精，直接影响到受精率。该项目的测定结果与活力直接相关，在总精子数不变的情况下，活力越高前进运动精子数越多。
    目前主要方法还是通过目测人工计数，主要使用器材有血球计数板、血色素管、1mL吸管、小试管、计数器、显微镜或电视显微装置、滴管、3.0%氯化钠溶液、血球计数板。
    细管精液用血色素管准确吸取20μL精液注入盛有0.98mL的3.0%氯化钠溶液的试管内，混匀，使之成为50倍稀释的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴稀释精液于血盖片边缘，使精液自行流入计数室，均匀充满，
    不允许有气泡或厚度过大，然后在显微镜下或电视荧光屏上观察计数。
每剂量中呈直线前进运动精子数计算方法:每剂量中精子数=5个中方格精子数×5(25个中方格精子数)×10(1mm3内精子数)×1000(每毫升样品的精子数)×50(样品稀释倍数)×剂量值上式可简化为:每剂量中精子数=5个中方格精子数×250万×剂量值 每样品观察上下两个计数室，取平均值，如二个计数室计数结果误差超过5%，应该重检。
每剂量呈前进运动精子数=每剂量中精子数×活力
技术要点:血球计数板使用前清洗干净，样品摇均匀，取样量适当，加样方法(自行流入)。计数时应注意，对于压在边界网格双线上的精子，以头部为准，数上不数下、数左不数右。检测过程中相互影响影响因素主要是血球计数板的精子计数、剂量值与精子活力的测定中，其中任何一个项目检测数据的变化，都可对每剂量中呈前进运动精子数的最终结果产生影响。

3精子畸形率
    精子畸形率(AbnormalSpermPercentage)是指精液中畸形精子占总精子数的百分率。精子畸形主要是指不正常的变型，如巨头、细小头、缺损、双头、梨型头、头部突起、颈部膨大，线粒体膨大、带有原生质点、无尾、尾部卷曲等，一般主要表现尾部畸形的为多。当畸形精子所占的比例大时就可能影响到受精率，畸形精子比例越高，受精率越低，因为这样的精子是不能参与受精的。牛精子在一般情况下，畸形率不应超过10%，如超过15%以上时受精率下降，50%以上时，受精率急剧下降。造成精子畸形(异常)的有些因素的影响是不可逆的(如老龄公牛、睾丸早期发育不良等)，有的是可逆的(如环境温度、营养等)，因此定期检查公牛的精子畸形(异常)率是十分重要的。
3.1检测方法
    精子形态检测、分析过程中的所有操作步骤都可能影响精子形态学分析的结果，如精液样品的稀释、制片、固定、染色方法、显微镜质量、自动化分析系统的质量等。精液直接抹片染色背景较杂，加之精液成分的影响，可能会产生一定的杂质沉淀，从而影响精子形态评估。因此，实际操作中多采用避免杂质成分在抹片上存留和染色的方法，这样的抹片不仅背景清晰，而且精子分散度好，有利于精子形态的观察分析。背景清晰更适用于计算机辅助的精子形态分析。精子形态检测主要使用仪器有显微镜(或者电视显微录像系统)血球分类计数器等。操作流程:精液样品→抹片→固定→染色→镜检→统计分析。
*人工目测:在显微镜下通过人工目测进行分析评价。*计算机(软件)的检测、分析:国内对于人的精子形态分析软件按照WHO(世界卫生组织)第五版对正常精子和异常精子的判别标准，不仅适应一份标本做二次检测的要求，而且能检验二次检测的均值是否在95%的可信区间，必要时还能标明误差。然而对于各个畜种精子形态分析软件基本不能投入到临床上使用，因为该软件目前无法分析每个畜种精子的缺陷，如大、小头精子、不定形头、顶体、颈部、线粒体、胞质小滴、尾部畸形等复杂的异常态，不能自动评估检测结果的可信度，最终还需要人工检测分析辅助。
3.1.1抹片
取精液一滴滴于载玻片一端，用另一边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈35°夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干(约5min)，每样品制作二个抹片。
3.1.2固定
在已风干的抹片上滴上1.0～2.0mL中性福尔马林，固定15min后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干。
3.1.3染色
将固定好后的抹片反扣在带有平槽的有机玻璃面上，把姬姆萨染液滴于槽和抹片之间，让其充满平槽并使抹片接触染液，染色1.5h后用清水缓缓冲去染液，凉干待检。
3.1.4镜检
将制备好的抹片在显微镜(400～600倍)下观察，每个抹片观察200个以上的精子(分左、右二个区)，取二片的平均值，二片的变异系数不得大于20%，若超过应重新制片。
3.1.5精子畸形率计算公式
精子畸形率=畸形精子数/精子总数×100。
3.2技术要点
3.2.1染色方法和染色液
目前主要采用的是姬姆萨染色法。自己配制染色液时，姬姆萨染料务必要充分研磨至无颗粒为止，贮存一定时间(便于充分溶解)，时间越久染色效果越好。市场上供应的姬姆萨染色液成品，使用方便，效果较好，购买时要注意选择是用于细胞染色的。
3.2.2制片(抹片)
掌握好呈35°夹角，样品均匀地拖布于载玻片上(见图1)、自然风干，避免人为造成尾部割断(见图2)。
3.2.3制片(抹片)的厚薄
要求均匀，熟练控制精子的密度要适中，在显微镜(400倍)视野下，精子大约在20个左右，如按照每个样片观察200个以上精子，这样可以满足观察左、中、右3个区域，至少10个以上视野，样片观察区域相对全面。如果密度过大，观察判断易遗漏，而且观察区域、观察视野减少，样片观察区域相对不够全面。如果密度过稀，增加了观察区域、观察视野，检测工作量加大。
3.2.4固定
掌握固定时间、冲洗和风干方法，尽量避免在这个过程中造成对精子形态上的变化，固定液配制过程中，对40%甲醛配比及使用碳酸镁中和过滤不能忽略。固定时间过长可能损伤精子;冲洗不当会把精子冲掉;样片最好采取自然状态风干，如果使用电吹风，要有适当距离，不要使用热风，以免因为热、干影响，造成精子尾部卷曲。
3.2.5染色
把握好染色时间，时间过长，玻片上的杂质同样染色，不易冲洗干净，影响观察效果。
3.2.6显微镜
调整好照明光路系统，调整好观察视野的清晰度，选择放大倍数应根据需要选择，对精子形态的观察，一般可选择10×40或10×100(油镜)的倍数。
3.2.7观察视野
每个抹片观察若干个视野、至少观察200个以上精子，分3个区域(左、中、右)，要计数完每个视野的精子(见下实例题):观察若干个视野，计数精子畸形率方法1:若干个视野、20个畸形、总数200，计算结果:20/200=10.0%(畸形率)。方法2:若干个视野、20个畸形、总数200，最后一个视野还有10个没数完，坚持数完，其中3个畸形、7个正常。计算结果是:20+3/210=11.0%(畸形率)。建议采用方法2。
3.2.8观察顺序
对视野中精子判别时按照习惯顺序，从左上开始→右，再至下层右→左，如此重复，不会有遗漏，如果精子某个部分超出视野，无法判别时，就不要计入观察数，见图3。
3.2.9观察结果
取两抹片的平均值，二片的变异系数不得大于规定值，若超过应重新制片。
3.3精子形态的判别
    检测人员素质应具备专业知识，了解精子形态的结构，熟悉对对标准形态精子的界定，因为对不同标准形态精子认同，可导致检测计数后非标准形态精子(畸形精子)所占的百分比不同。
    精子畸形分为原发缺陷和继发缺陷两种，检测人员要能够基本判别，对于继发缺陷的精子(畸形)需要分析是否与人为操作不当造成。目前实际工作中需要的是给出常见的畸形(非标准形态)精子图谱，这样可以有助于检验人员对精子形态的分析、评价。对视野中精子观察的顺序一般情况下先从头部观察是否正常，后才继续分析精子其他部分。随时记录评价结果。

4精子顶体完整率
    在精细胞头前部类似有一半圆形帽子称为“顶体”，在顶体中至少存在着几种与受精有关的酶，当顶体受到破坏时，该酶释放到精清中，使精子失去受精能力。张坚中在牛、绵羊和猪的试验都证明，精子顶体完整率与受精率显著相关。所以国内外的一些相关技术文件中提出，推广人工授精使用的精液中，精子顶体完整率不能低于一定的比例，其目的是要保证有一定数量顶体未受损，可完成受精的精子。
4.1检测方法
    方法同本文中3.1部分。
4.2技术要点
    选择1000倍油镜，无需使用相差镜头。以精子顶体观察为例，在图4中(400倍)，左下的精子顶体脱落，在图5中(1000)倍，右上的顶体半揭开，1000倍下可以清楚观察到顶体的不同膨胀程度和细小缺口，而在400倍下观察有一定难度。顶体形态的类型基本分为:正常(有明显的顶脊，顶体部分呈均匀一致的紫红色，核环部分呈规则的月牙形)，轻微膨胀(顶脊消失，顶体部分的染色深浅不一)，严重膨胀(顶体严重膨胀后，其边缘出现皱褶有明显的条纹或者膨大呈冠状)，顶体脱落(顶体部分脱落或揭开，完全脱落露出细胞核)。

5精子存活时间
    这是观察精液中精子在一定的环境条件下维持生命活动的时间，也是检验家畜(精液)受精能力的一个重要指标，通过该项指标的观察，评价精液中精子在阶段时间内的生命能力，某些精子活力下降缓慢，存活时间长的，说明该公畜精子的生命力强，则可能受精能力强;该项目的检查，公畜间可能存在着个体的差异，差异的原因是复杂的，据研究，这与公畜的年龄、生存的环境条件和遗传都有着密切的关系。
5.1检测方法
    通常是选择两个环境条件进行验证，一是在37℃环境温度中保存4h，另一是在5～8℃环境温度中保存12h，具体观察在该阶段的精子活力和精子存活的数量。
5.2技术要点
5.2.1温度
保存的环境温度要求稳定，样品数量不能低于3个剂量，结果取平均值。
5.2.2环境条件
保存环境要避光，在37℃环境温度中保存4h的，注意环境要保证一定的湿度(如在恒温箱中可放置一小杯水)。
6检测质量的控制
  人工检测分析过程中，人为因素是影响分析结果的主要因素，这个因素常常表现在检测人员的技术水平和个人的主观性方面，它可以很大程度影响检测结果，为此实验室需要制订有效的质量控制方案，以保证检测结果的可靠性，具有以下几方面。
6.1技术人员的培训
     对所有参与检测的技术人员集中进行严格的培训，统一检测方法与分类标准。培训主要内容包括制片技术和读片技术，对正常形态精子有统一正确的认识，能够熟练鉴别非标准形态精子并准确计数。确实掌握实验原理及检测技术要点。
6.2检验比对
     作为一个整体，开展经常性的检验比对，统一检测的方式、方法，可显著提高检测水平，保证检测结果的可信度。关于比对测试标本的选取，要保证标本具有典型性，同时标本还要具有一致性。这种标本要控制的基本参数包括精子密度、正常精子数、活力等。
6.2.1实验室内部比对
     监控技术人员检测水平，实行定期检验比对，提供同一样品标本交各技术人员对其进行精子形态检测和分析，一是各技术人员之间的比对，二是个人的重复试验，如果误差在允许范围内，检测合格;若超过允许范围，则需找出原因并加以记录。
6.2.2实验室之间比对
    尽管各实验室已进行质量控制，统一了精子形态检测、评价方法，但实验室间的检测结果有可能还是存在差异，所以需要对各实验室检测结果进行比较分析。通常是确定一个中心实验室牵头，定期将统一样品标本分别送给各实验室检测、分析，检测结果反馈回中心实验室，中心实验室对反馈结果进行比较、分析。重点分析各实验室检测差异、参数平均值、变异系数(CV)、标准差(SD)等。

7小结
     家畜精液质量检测是一项常规技术，目前广泛应用于畜牧业生产中。人工授精使用的精液质量不仅取决于精液的遗传品质，同时精液的繁殖性状(精子活力、每个输精剂量中呈直线前进运动精子数、精子畸形率、精子顶体完整率、精子存活时间)也为重要。对精液质量进行准确与可靠的检测，需要规范的检测技术，同时对检测过程进行质量控制必也不可缺少，否则行业内很难做到家畜精液质量检测方法的统一和规范，导致检测结果的科学性与可信度受到影响。

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