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宁家宝 陈建红 张济培 梁梓森 司兴奎 牛森
佛山科学技术学院动物医学系
华南农业大学兽医学院
本研究旨在检测珠三角地区鸡白痢沙门菌对磺胺药的耐药性及相关耐药基因， 阐明鸡白痢沙门菌对磺胺药物的耐药机制、 耐药水平、 耐药分布， 为鸡白痢沙门菌的预防和治疗提供更多的科学依据。
1材料与方法
1.1菌株来源
69株鸡白痢沙门菌于2005年7月~2011年7月自珠三角地区鸡群分离、 纯化、 鉴定、 保存。药敏质控菌大肠埃希菌ATCC25922购于美国典型菌种保藏中心。
1.2药品及试剂
LB肉汤粉和木糖赖氨酸脱氧胆盐 （XLD） 琼脂粉为广东环凯微生物科技有限公司产品。DL2000 DNA Marker、 pMD18- T 载 体 、 premixEx Taq酶等为大连宝生物工程有限公司产品； 琼脂粉和SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒为生工生物工程 （上海） 有限公司产品； 磺胺异恶唑分析纯药粉为Amresco公司产品。
1.3引物设计与合成
参照GenBank中登录的耐药基因序列及相关文献［1， 2］设计了3对引物 （见表1） ， 由生工生物工程 （上海） 有限公司上海合成部完成。
1.4菌株的复苏
取-40 ℃保存的菌种划线接种于XLD固体培养基上， 于37 ℃培养16 h； 挑取单个典型菌落接种于LB液体培养基中， 置于37℃摇床过夜培养。
1.5药物敏感性试验
根据CLSI制定的试验方法和判断标准进行药敏试验， 以大肠埃希菌ATCC25922作为药敏质控菌株， 测定69株鸡白痢沙门菌对磺胺异恶唑的敏感性。
1.6耐药基因的PCR扩增
参照 《分子克隆实验指南》 ， 采用煮沸法提取细菌 DNA 模板进行 PCR 反应。PCR 反应体系（25 μL） ： Premix Ex Taq 11.5 μL， 双蒸水9.5 μL，DNA模板3 μL， 上、 下游引物各0.5 μL。循环参数： 热盖5 min， 94 ℃预变性5 min； 94 ℃变性40 s，55 ℃退火45 s； 72 ℃延伸45 s； 进行35个循环， 最后72 ℃延伸10 min， 16 ℃保温， 于-20 ℃保存备用。PCR扩增产物在1.2％的琼脂糖凝胶中进行电泳， 在凝胶成像分析仪上观察电泳结果。
1.7产物的回收、 克隆及测序
将PCR产物回收纯化， 与PMD18-T载体于16 ℃连接2 h后， 转化于感受态细胞DH5α， 在氨苄青霉素抗性平板上筛选出可疑阳性克隆株送作序列测定。
2结果
2.1耐药性检测结果
在 69 株鸡白痢沙门菌中， 75.4% （52/69） 对磺胺异恶唑产生了耐药性， 24.6% （17/69） 对磺胺异恶唑敏感， 其中 MIC50 值和 MIC90 值均为512 μg/mL。
2.2耐药基因检测结果
经PCR和琼脂糖凝胶电泳分析， 69株鸡白痢沙门菌分别扩增出磺胺类耐药基因SulⅠ和SulⅡ的菌株比例分别为33.3% （23/69） 和79.7% （55/69） ，其中同时携带2种基因的有16株。未能检测到耐药基因SulⅢ。在52株对磺胺异恶唑耐药的鸡白痢沙门菌中， 46株携带磺胺类耐药基因， 符合率为88.5%。BLAST比对测序结果表明， 所扩增出的耐药基因 SulⅠ和 SulⅡ与 GenBank 数据库中目的基因序列的相似性大于98%。检测结果见表2及图1、 2。
3讨论
磺胺药较早被应用于鸡白痢的预防和治疗，但是由于长期使用甚至滥用， 导致了鸡白痢沙门菌对磺胺类药物逐渐产生了耐药性［3］。本研究69 株鸡白痢沙门菌对磺胺异恶唑的耐药率为75.4%， 与仇莉等［4］报道的受试菌对磺胺异恶唑有较高的耐药性结果一致。
细菌耐药性的产生与其含有的耐药基因有着密切关系。本研究检测磺胺类耐药基因结果表明， 69株鸡白痢沙门菌以基因SulⅡ检出率最高（79.7%） ， 其次是SulⅠ （33.3%） ， 未能检出SulⅢ。董洪艳等［5］检测了从江苏东台及周边地区分离的33株鸡白痢沙门菌的磺胺类耐药基因， 结果有94.4%的菌株携带耐药基因SulⅠ， 没有检测出耐药基因SulⅡ， 与本研究的结果有所差异， 可能是不同地区用药类别、 用药量不同导致菌株携带的耐药基因也有所不同。磺胺类耐药菌株中检测出以上其中一种或者两种耐药基因的菌株占耐药总数的88.5%， 即符合率为88.5%。本研究中有7株受试菌对磺胺异恶唑的耐药表型为敏感检测到基因SulⅠ， 另外10株受试菌表型敏感检测到基因SulⅡ， 3 株受试菌表型敏感却同时含有基因型SulⅠ和SulⅡ， 可能是这些受试菌的耐药基因尚未得到表达， 或者存在其他机制， 需进一步研究。综上所述， 本研究表明耐药基因SulⅠ和耐药基因SulⅡ对磺胺类耐药菌株的出现起着关键的作用。
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