2014年对大连地区的猪源大肠杆菌耐药性调查分析报告

吴静 杜雄伟 狄文婷 于凤娟 魏怡 苏日娜 大连民族学院

    近几十年来， 养猪专业户为了谋求利润， 减少损失， 将各种抗菌药物用于集约化生产中来减少猪仔生病。由于抗菌药物长期不断的使用， 大肠杆菌渐渐的出现了抗药性， 耐药谱也不断扩大。媒体曾报道过超级大肠杆菌， 耐药性极强， 极不容易被杀死， 若人类感染这种超级大肠杆菌是很难治疗的。 因此， 应该积极开展猪大肠杆菌耐药性的监测， 以合理的方式用药， 竭力制止大肠杆菌耐药谱的扩增， 以最有力合理方法减少耐药菌株的出现。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株
生鲜销售地共采集了猪肉样品 69 个。包括猪五花肉， 后腿肉， 肥肉， 猪皮等主要销售样品。2012 年 11 月在食用猪养殖场采集了猪饲料，饮用水， 猪粪便等样品 62 个。

质控菌： Escherichia coli ATCC25922
1.2方 法
1.2.1大肠杆菌的分离和 PCR 鉴定
切采集的样品 1~2g 放进营养肉汤培养基里， 摇匀。放进摇床，在 37℃， 150rpm 的转速下增菌 16~18h。 用 25~30mL麦康凯培养基倒平板，接种环沾菌液后在平板上 Z形划线， 放进 37℃恒温隔热培养箱， 培养 24h。将红色或粉红色不透明单菌落放进营养肉汤进行纯培养。用煮沸法制备 PCR 模板。设定 PCR 反应程序：94℃预变性 4min;94℃变性 1min,60℃退火， 72℃延伸 1min,30 个循环； 72℃延伸 7min,4℃保存。PCR 产物经电泳鉴定。
1.2.2大肠杆菌药敏试验
（1 ） 菌液制备
用营养肉汤稀释被复苏的保存菌液，用分光光度计测量稀释菌液达到 OD600=0.4～0.5。再按 1： 100 稀释菌液至含菌量约为 1×106CFU/mL， 备用。
（2 ） 微量稀释法测 MICs
将全部抗生素配为5120μg/mL 的储存液存放在冰箱中待用。将储备药液分别稀释至256μg/mL 的工作液。 在无菌的 96 孔聚苯乙烯 U 型微量板内用排枪每孔加营养肉汤 100μL，256μg/mL 的工作液 100μL 加在第一排， 混匀， 再把第一列的混合液吸 100μL 加在第二列， 以此类推同样方法操作至第 12 个孔， 最后第 12 孔的混合液吸 100μL弃去。第一板 1~8 号药品， 第二板 9~15 号药品， 最后一排的前 6 孔加菌液作为阳性对照， 后 6 孔空白营养肉汤作为阴性对照，以 Escherichia coli ATCC25922， Escherichia coli ATCC35218 作为质控。 孔板加完药品后加盖标注样品号和药品号放进培养箱， 37℃培养16h 后观察结果。
（3 ） 药敏试验判定标准
当阳性对照组细菌明显生长， 阴性对照组无细菌生长时， 以实验组小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC 值， 即小孔内溶液不变混浊所对应的最低药物浓度。当出现单一跳孔时，记录抑制细菌生长的最高药物浓度，如多次出现跳孔现象， 则不记录结果， 需重新进行试验。

2结果与分析
    从样品中共分离到了 69 株菌，经过 PCR 检测后 61 株为大肠杆菌， 占市场总样品数的 88%。屠宰场样品中分离到了 62 株菌，其中 56 株为大肠杆菌， 占总样品数的 90%。
2.1受试大肠杆菌耐药性分析
    通过药敏试验发现大肠杆菌分离株对盐酸环丙沙星抗菌性最高， 达52 株， 占受试菌株的 88.5%， 其次为硫氰酸红霉素（85.3%） ， 土霉素 （83.6%） ， 硫酸庆大霉素 （78.7%） ，阿莫西林 （78.7%） ， 磺胺间甲嘧啶钠 （78.7%） ， 硫酸黏菌素 （75.5%） ， 烟酸诺氟沙星 （68.8%） ， 恩诺沙星（65.6%） ， 硫酸新霉素 （65.6%） ， 乙酰甲喹 （62.3%） ，乳酸环丙沙星 （57.4% ） 等具有耐药菌株分别 51 株，48 株， 48 株， 48 株， 46 株， 42 株， 40 株， 40 株， 38株， 35 株， 耐受率均超过 50%， 受试菌株对盐酸多西环素最为敏感，耐药菌株仅有 13 株占受试菌株的21.3%，其次比较敏感的是盐酸沙拉沙星耐药菌株有 22 个占总受试菌株的 36.1%，其次是氟苯尼考（45.9% ） 。
2.2重耐药性的分析
    大肠杆菌的多重耐药谱：全部 61 株受试菌株均表现为多重耐药，至少是 5重耐药， 最多重数是 13 重。其中 10 重耐药菌株最多， 占全部菌株的 29.8%， 其次为 12 重 （22.9%） ， 11重 （9.8%） ， 7 重(9.8%),13 重 （8.2%） ， 6 重 （6.5%） ， 9重 （4.9% ） ， 8 重 （4.9% ） ， 5 重 （3.2% ） 。13 重耐药有 3种耐药谱； 12 重耐药有 5 种； 11 重耐药有 3 种； 10重耐药有 8 种； 9 重耐药 1 种； 8 重耐药 3 种； 7 重耐药 4 种； 6 重耐药 1 种； 5 重耐药 1 种。其中 12 重耐药中 FLO-NEO-AMO-NOR-ERY-SOL-C/L-COL-TER-ENR-CIP-EMQ 最常见， 共有 5 株 （8.2% ） 菌株表现为此耐药谱。
目前， 细菌的耐药现象己经十分严重， 并有逐年上升趋势， 导致临床治疗效果差、 治疗时间延长、死亡率和临床发生率增加、 治疗费用上涨。细菌耐药菌株的传播和多重耐药菌株的出现， 是导致各类传染病治愈受限的主要原因之一。
    本研究对 61 株大肠杆菌进行了 15 种抗生素的耐药性分析。结果这些菌对 15 种抗生素的耐药性均在 20%以上。 最高达到 88.5%， 是对盐酸环丙沙星， 耐药性最小 21.3%， 是对盐酸多西环素。由此来看， 大连猪源大肠杆菌的耐药性明显提高， 致使许多养殖场越来越增加药品的用量。我国尚未建立完善的抗生素管理体系， 这样的恶循环不断出现， 滥用抗生素的行为导致细菌的耐药性会越来越高， 经济损失也将越来越大。
    现如今， 提倡合理使用抗生素， 联合用药， 交叉用药或者研发新型抗生素， 进一步研究大肠杆菌的耐药机制和耐药谱， 方可实现对其耐药性的有效控制。

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