2014年饲用微生态制剂益生特性的研究进展

邢力 李英利 杨雪娇 宋帅华
吉林农业科技学院生物工程学院
吉林市女子中学

    在畜牧生产上，饲用微生态制剂作为一种无毒、无残留且无抗药性的饲料添加剂已经成为替代抗生素有效的产品之一。饲用微生态制剂的一个重要特征是抑菌性，对肠道有害菌如大肠杆菌和沙门菌等引起的肠道疾病有预防和治疗作用。微生态制剂进入宿主肠道中，必须对肠道上皮细胞具有黏附性才能定植，微生态制剂黏附和定植于宿主肠道的能力是评价微生态制剂的重要标准之一。文章研究某种饲用微生态制剂的抑菌性和黏附性，为该饲用微生态制剂的生产和质量评价提供试验依据。

1材料与方法
1.1材料与仪器
    试验材料: 某畜禽饲用微生态制剂，其菌种组成: 枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和粪链球菌，活性益生菌含量 ≥ 1. 5亿 CFU/g。该微生态制剂具有无毒、无残留、改善肠道环境和促生长，提高动物免疫力、抗应激能力及饲料利用率等多种作用。
试验菌种: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌 (由吉林农业科技学院微生物实验室提供); 7日龄肉鸡; 试验试剂: 蛋白胨、牛肉浸膏、琼脂粉、酵母浸粉、PBS 缓冲液、Hanks 平衡盐溶液、蔗糖缓冲液、革兰试剂和乙二胺四乙酸 (EDTA)缓冲液等。仪器: 高低温恒温培养箱、恒温振荡培养箱、显微镜、倒置显微镜、高压灭菌锅、超净工作台和低温离心机等。
1.2抑菌试验
1.2.1指示菌的制备
    将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌接种到肉汤培养基中，置于 32 ℃ 恒温箱中 18 ～ 24 h，进行扩大培养。将细菌质量浓度调至 10 万 CFU/mL。
1.2.2培养基接种
    将 0. 1 mL 指示菌接种到固体培养基表面，涂布均匀，待菌液稍干后倒置，备用。
1.2.3饲用微生态制剂的抑菌效果
    通过牛津杯法测定饲用微生态制剂分别在不同质量分数 (85%、75%、50%、25%、15%、10%和 0)、pH (2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0 和 7. 0)、温度 (85、80、50、37 和 25 ℃) 条件下对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门菌的抑菌圈直径，评价其抑菌效果。
1.3黏附性测定
1.3.1鸡回肠上皮细胞的分离选 12 只 7 日龄健康肉鸡，禁食 12 h。处死后迅速分离出回肠，取 12 cm 左右肠管做如下处理:PBS 缓冲液反复冲洗肠→末端结扎→蔗糖缓冲液灌入肠至轻度膨胀→结扎另一端→室温放置 30 min→倾去肠内液体→EDTA 缓冲液灌充结扎→放入灭菌PBS 缓冲液中孵育 (37 ℃，30 min，振荡并轻揉肠壁) →肠内液体倒入离心管→反复吹打至单个细胞→离心 (4 ℃，3 000 r/min，10 min) 去上清→Hanks 平衡盐溶液洗涤离心 3 次→镜检调细胞质量浓度 (100 万个/mL)。
1.3.2黏附性的测定
    分别取 1 mL 新分离的小肠上皮细胞悬液和饲用微生态制剂 (含菌数为1.5 亿 CFU/mL) 混合培养(37 ℃，30 min) →离心 (3 000 r/min，10 min) →去上清→无菌水洗涤，离心 4 次→PBS 缓冲液悬浮混合培养的细胞团块→制涂片→甲醛固定 10 min→涂片固定→草酸铵结晶紫染 1 min→自来水冲洗→碘液染色约 1 min→水洗→吸水纸吸去水分→加 95%乙醇数滴脱色→20 s 后水洗→吸去水分→蕃红染色液染 2 min 后→自来水冲洗→干燥; 另取新分离的小肠上皮细胞悬液和无菌水各 1 mL，操作同上。油镜观察，随机计数 100 个形态清晰的细胞上所黏附的细菌数目，计算其黏附率。

2结果与讨论
2.1饲用微生态制剂质量浓度对饲用微生态制剂抑菌效果的影响
    从图 1 可见: 饲用微生态制剂对大肠杆菌的最小抑菌质量分数在 10%以下，对金黄色葡萄球菌的最小抑菌质量分数为 15%以下，对沙门菌的最小抑菌质量分数为 15% 以下。对大肠杆菌抑菌效果最好，对沙门菌抑菌效果最小。试验结果表明: 该饲用微生态制剂原液的抑菌谱较广，并且随着微生态制剂质量分数的增高，菌圈直径增大，说明微生态制剂的抑菌作用随着质量分数的增大而增大。对于不同种类的细菌均表现出抑制作用。江汉湖等 (1998) 报道，饲用微生态制剂中的类细菌素对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌有抑制作用，且随着微生态制剂的质量分数增大，抑菌效果增强，试验结果与其基本一致。
2.2pH 对饲用微生态制剂抑菌效果的影响
在到达肠道前，益生菌必须通过胃，胃酸的低pH 是益生菌进入宿主体内后所遭遇的第一防御屏障。胃酸的 pH 根据动物种类和生长阶段不同一般在 2. 0 ～3. 5 波动。从图 2 可见: 该饲用微生态制剂在 pH 5. 0 时抑菌活性最高，在 pH 2. 0 时仍具有抑菌活性，即在相当于胃液的酸性条件下仍具有抑菌活性。目前，饲用微生态制剂亟待解决的问题是进入消化道后耐受力低，难以有足够的活菌到达肠道或定植肠道发挥抑制作用，试验结果表明该微生态制剂具有一定耐酸性。
2.3温度对饲用微生态制剂抑菌效果的影响
    制粒是饲料加工的重要工序之一，制粒温度会影响微生态制剂中活菌的存活率，高温高湿环境对微生物有致死作用，所以研究饲用微生态制剂的抑菌活性时也应考虑到温度的因素。
从图 3 可见: 该饲用微生态制剂在 37 ℃ 抑菌效果最好，但在 85 ℃ 时仍具有抑菌效果。崔云龙等 (2005) 报道，益生菌在模拟肠道内温度时抑菌效果最好，试验与其报道相符; 当温度达到 80 ℃时，饲用微生态制剂仍具有较好的抑菌效果，说明该制剂具有一定的耐热性。
2.4
    饲用微生态制剂对鸡肠上皮细胞的黏附性测定Garriga 等 (1998) 采用体外试验 (下转第33 页)研究鸡胃肠道乳酸菌黏附性时，认定每个细胞黏附10 个细菌为具有黏附性，黏附性试验测定出每 100个细胞上黏附细菌数平均为 (3 044.38 ±58.21) 个，黏附率为 (20.39 ±0. 39)%; 而对照组每 100 个细胞上细菌数仅为 (34. 63 ± 4. 41) 个; 说明该饲用微生态制剂的黏附效果很好。

3结论
    试验所测饲用微生态制剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌均有抑菌效果，且抑菌作用受质量分数、pH 和温度等不同因素的影响。不同质量分数的饲用微生态制剂原液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌均有抑菌作用，并且随着质量分数的增大抑菌活性增强; 该饲用微生态制剂原液的最佳抑菌 pH 约为 5. 0，最佳抑菌温度为 37 ℃，且具有较好的耐酸性和耐热性。
该微生态制剂在 100 个形态清晰的鸡肠上皮细胞上黏附数平均为 (3 044. 38 ± 58. 21) 个; 对肠上皮细胞的黏附率平均为 (20. 39 ±0. 39)%，表明该微生态制剂黏附效果较好。

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