新疆小反刍兽疫疫情诊断

新疆小反刍兽疫疫情诊断

清华 刘春菊 吴晓东 王华 王明国 王永生 田建龙 盛卓君 林汉亮
马伟 李林 任炜杰 王淑娟 赵文年 包静月 王志亮
中国动物卫生与流行病学中心国家外来动物疫病诊断中心
新疆伊犁州动物疾病控制与诊断中心
新疆伊犁州霍城县畜牧兽医站
新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心

   小反刍兽疫（Peste des Petits Ruminants， 简称 PPR）是一种感染山羊、绵羊和野生小反刍兽的严重的烈性、接触性传染病，特征为发热、口腔及舌黏膜糜烂、流泪、流鼻液、腹泻和肺炎。本病是世界动物卫生组织（OIE）法定报告的动物疫病，我国将其列入一类动物疫病。本病发病率可达100%，严重暴发期病死率为 100%，中等暴发期病死率不超过 50%。小反刍兽疫最早于 1942 年发生于西非，1970 年至 1972 年间，PPR 首次在东非国家苏丹发生，1983 年传至阿拉伯半岛，1987 年传至印度南部。 在非洲， PPR流行于中部和北部非洲。在亚洲，PPR 在中东、中亚和南部亚洲的大部分国家流行，对我国西部边境省份形成包围态势。从遗传进化关系上，PPRV 可分为 4 个谱系，谱系 4分布最广，分布于南亚、中东和北部非洲，谱系 3分布于中东和东非，谱系 1 和 2 仅见于非洲。2007年7—9月，我国西藏首次暴发PPR疫情。该疫情涉及西藏阿里地区革吉县、日土县、扎达县和改则县4个县、 10个乡镇、 13个村， 共出现20个疫点，羊发病 6122 只，死亡 1888 只。流行病学调查结果表明，2005 年 PPR 可能就曾经传入与印度接壤的日土县热角村，但未被确诊。PPR 可能从印度传入，在阿里境内缓慢向东扩散。2008 年西藏阿里地区革吉县文布当桑乡罗玛村发生野生岩羊小反刍兽疫疫情，未见家畜发病。2008 年 6 月初，在那曲地区尼玛县双湖区嘎措乡发生PPR疫情。 2010年5月，阿里地区日土县多玛乡乌江村斯亚点发生 PPR 疫情。我国西藏 PPRV 流行毒株属于谱系 4，与印度等国流行毒株遗传进化关系最近。 通过采取扑杀、大规模免疫、检疫和移动控制、野生动物控制等综合防控措施，上述疫情得到有效控制。此后，我国再无新的 PPR 疫情报道。
    2013 年 11 月 27 日，新疆伊犁州霍城县发生不明山羊疫情。本研究经临床症状、剖检变化、病原学和血清学诊断，确诊该起疫情为小反刍兽疫病毒感染。这是我国新疆首次报道发生小反刍兽疫疫情。
1　材料和方法
1.1　疫情概况
霍城县兽医站于 2013 年 11 月 27 日接到霍城县三宫乡兽医站报告，霍城县三宫乡一村民饲养的2700 只山羊，发病山羊 1000 余只，陆续死亡 100多只。
1.2　样品采集
    采集发病 6 只发病山羊的血清，采集 8 只发病山羊的口鼻棉拭子，解剖三只发病山羊，分别采集肺、肺门淋巴结、肺气管、脾、肾、大肠、肠淋巴结、肝等组织，送中国动物卫生与流行病学中心进行检测。
1.3　实验室诊断
    对于送检样品开展小反刍兽疫的检测。对血清样品用竞争 ELISA 试剂盒（英国 BDSL 公司）检测小反刍兽疫抗体。取适量组织样品加 PBS 进行研磨，制备组织匀浆液，将组织匀浆液和棉拭子样品分别进行小反刍兽疫抗原检测和病毒核酸检测。抗原检测使用小反刍兽疫抗原捕获 ELISA 试剂盒（英国 BDSL 公司）。病毒核酸检测使用两种方法，分别为荧光定量RT—PCR[6]和基于 N 基因的 RT—PCR[7]。对荧光定量 RT—PCR 和 RT—PCR 阳性的样品分别进行N 基因片段和 F 基因片段的扩增和序列测定。
1.4　病毒分子特性分析
    使用本中心数据库和 GenBank 下载的小反刍兽疫病毒基因序列，分别针对 N 基因编码序列的 1253~1507 nt 片段序列和 F 基因编码序列的254~575 nt 片段序列，使用 MegAlign 软件进行序列比对和相似性比较，使用 MEGA4 软件进行遗传发生分析，构建进化树。
2　结果
2.1　现场调查
霍城县三宫乡一村民饲养的 2700 只山羊，发病山羊 1236 只，陆续死亡 203 只。发病率为
45.8%，病死率为 16.4%。
2.2　临床症状
病山羊精神不振， 呼吸困难， 腹式呼吸， 呼吸次数 58 次 / 分钟， 咳嗽， 鼻腔和眼睛有脓性分泌物。体温升高至38.8~40.1ºC不等， 腹泻， 有个别流产。 （图1）
2.3　剖检变化
   共解剖四只山羊，剖解变化有，心脏增大、壁变薄。一侧肺胶冻状纤维素性物渗出，肺充血，肺、纵膈、心包粘连，气管出血。肺门淋 巴结出血。肝肿大，呈土黄色，胆囊肿大。大肠粘膜充血，肠系膜淋巴结炎充血肿大，化脓。大肠粘膜出血、糜烂、有条纹状出血。肾脏有出血点和水肿，脾脏无明显变化。上消化道没有明显病变（图 2）。
2.4　抗体检测
六份发病山羊血清样品经小反刍兽疫竞争
ELISA 方法检测，都为 PPRV 特异性抗体强阳性。
2.5　抗原检测
三只病死山羊的组织样品和 8 只发病山羊的口
鼻棉拭子样品，经小反刍兽疫病毒抗原捕获 ELISA
检测，都为阳性。
2.6　小反刍兽疫病毒荧光定量 RT—PCR 检测结果显示，从三只病死山羊的组织样品和 8 只发病山羊的口鼻棉拭子样品中，都能检测到特异性扩增曲线，Ct 值为 20.51~33.47（见图 3）。
2.7　小反刍兽疫病毒 RT—PCR 检测结果显示，三只病死山羊的组织样品和 8 只发病山羊的口鼻棉拭子样品，在 350 bp 左右都有特异性扩增条带，与阳性对照一致（图 4）。
2.8　N 和 F 基因片段序列比较和遗传发生分析针对 2 号样本进行 PPRV N 基因片段和 F 基因片段的扩增，对 PCR 产物进行序列测定，获得长度为 255 bp 的 N 基因片段序号和长度为 322 bp 的 F 基因片段序列。与数据库和 GenBank 下载的相应序列进行序列比对， 结果显示， N 基因片段与小反刍兽疫病毒 Nigeria 75/1 疫苗株的同源性为 87.5%，与西藏流行株的同源性为 96.5%， 与阿联酋 2009 年 Ibex 株及巴基斯坦 2012 年流行毒株序列相似性为 98.4%。F 基因片段与小反刍兽疫病毒 Nigeria 75/1 疫苗株的同源性为 92.7%，与西藏流行株的同源性为 97.5%，与巴基斯坦 2007 年分离株序列相似性为 99.7%，与Iran2010 年流行株相似性为 99.4%（表 1） 。N 基因片段序列的遗传发生分析显示，该毒株属小反刍兽疫病毒谱系 I V，与巴基斯坦 2010 及2012 年流行毒株、塔吉克斯坦 2004 年流行毒株以及阿联酋 2009 年 Ibex 株遗传发生关系最近，与西藏 2007 年流行毒株分别属于两个小分支（图 5 左）。F 基因片段序列的遗传发生分析表明，该样本病毒属于谱系 IV，与与巴基斯坦 2010 年流行毒株、伊朗2010 年流行毒株遗传发生关系最近，同样，与西藏2007 年流行毒株分别属于两个小分支（图 5 右）。
3　讨论
    2007 年西藏首次发现小反刍兽疫，本实验室所做的毒株遗传进化分析结果表明，其来源于印度流行株，随后，在流行病学调查中得到证明。根据临床症状和剖检变化，通过抗体检测、抗原检测、病毒核酸检测，对新疆首例小反刍兽疫疫情进行确诊，基因序列同源性分析以及遗传进化分析结果显示，新疆 PPRV 毒株也属于谱系 4，但是为独立于西藏流行株的一个新毒株。此次新疆 PPRV 毒株与巴基斯坦等国流行毒株遗传关系较近，表明其由周边国家传入的可能性最大。
    新疆陆地边境线 5600 多公里，周边与哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦、塔吉克斯坦、巴基斯坦、蒙古、印度、阿富汗、俄罗斯等八个国家接壤。在这八个国家中，小反刍兽疫在印度、巴基斯坦、阿富汗等国呈地方性流行，而塔吉克斯塔和哈萨克斯坦也曾有 PPR 疫情报道。2013 年 9 月，塔吉克斯塔向 OIE 报告发生 PPR 疫情。但是，新疆历史上从来没有 PPR 疫情报道。根据调查，发病羊群所在疫点为一新建的养殖小区，养殖户从羊贩处购得羊只用于育肥后出售。养殖密度大，而且冬季草料缺乏，羊只营养状况差，是发生疫情的诱因。目前，需要尽快开展疫情溯源。

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